罗 清,张 露,黄自坤,符碧琪,李俊明
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种病因不明的、以免疫性炎症为突出表现的自身免疫性疾病,其特征是出现多种致病性自身抗体,导致多器官、多组织损伤[1]。虽然SLE的发病机制尚不清楚,但大量研究[2]证实滤泡辅助性T细胞与SLE的发生发展密切相关。近年来发现在自身免疫性疾病炎症组织和外周血中存在一种新型CD4+T细胞亚群,定义为“外周辅助性T细胞”,即程序性死亡因子1(programmed death 1, PD1)阳性的CXCR5-CD4+T细胞(PD1+CXCR5-CD4+T)[3-4]。且研究[5-7]表明PD1+CXCR5-CD4+T细胞的功能与滤泡辅助性T细胞类似,可促进B细胞向浆细胞的转化和致病性自身抗体的产生从而参与SLE的致病。但目前并未见系统性的探讨PD1+CXCR5-CD4+T细胞上PD1表达平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)的临床意义。
目前用于SLE诊断的临床表现和实验室检查会造成一定程度的SLE漏诊和误诊[8-9]。近期,有研究者提出可采用免疫细胞和常规指标的联合建模来预测疾病以及评估疾病的严重程度[10-11]。该研究首次以PD1+CXCR5-CD4+T细胞为研究目标,联合常规指标建模,探讨CXCR5-CD4+T细胞上PD1的表达含量以及预测模式在SLE预测中的价值。
1.1 临床资料本研究募集了2019年5—9月在南昌大学第一附属医院风湿免疫科就诊的SLE患者47例(男3例,女44例),平均年龄(36.9±13.4)岁,采用的SLE诊断标准为1997年美国风湿病学会(ACR)制定的SLE分类(诊断)标准[12],并排除肿瘤、感染、肾功能衰竭、其他自身免疫性疾病等。详细收集SLE患者相关临床信息及实验室检查数据,并根据评分标准计算其疾病活动性评分(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)[13],平均SLEDAI(10.3±5.9)分,按SLEDAI是否≥10分,将SLE患者分为活动组22例和非活动组25例。SLE患者根据病情严重程度采用激素和(或)免疫抑制药物(SLEDAI<9分病情轻度活动者用泼尼松或糖皮质激素+羟氯喹/甲氨蝶呤/来氟米特,SLEDAI为10～14分的病情中度活动者用糖皮质激素+环磷酰胺/霉酚酸酯,SLEDAI≥15分病情重度活动者先用糖皮质激素冲击加环磷酰胺,再按病情中度活动治疗方案)进行治疗。入选的47例SLE患者有6例在治疗前后(至少治疗1周)均收集了血液样本。同时期,收集了35例健康志愿者作为健康对照(healthy control, HC)组(男4例,女31例),并排除具有风湿病史和有风湿病家族史,平均年龄(41.7±9.2)岁。两组在性别、年龄上差异均无统计学意义。本研究获得了医院伦理委员会的批准[批准号:(2022)CDYFYYLK(06-005)]。
1.2 试剂和仪器本研究采用的流式细胞抗体:鼠抗人PD1抗体(fluorescein isothiocyanate-PD1,FITC-PD1)、CXCR5抗体(PC7-CXCR5)购于美国eBioscience公司;鼠抗人CD4抗体(phycoerythrin-texas red,ECD-CD4)及相应的同型对照抗体FITC-IgG1购自美国Beckman Coulter公司。抗核抗体(antinuclear antibodies, ANA)、抗双链DNA抗体(anti-double strand DNA antibody, anti-dsDNA)、抗Sm抗体(anti-Smith antibody, anti-Sm)、抗SSA抗体(anti-Sjögren syndrome A antigen antibody, anti-SSA)、抗SSB抗体(anti-Sjögren syndrome B antigen antibody, anti-SSB)、anti-Ro52、抗组蛋白抗体(anti-Histone)、抗核小体抗体(anti-nucleosome, anti-AnuA)、抗抗糖体蛋白P抗体(anti-ribosomal P-protein antibody, anti-Rib-P)检测试剂盒购自欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分离液(Ficoll-Paque)购于美国Sigma公司。流式细胞仪Cytomics FC 500购于美国Beckman Coulter公司,采用的分析软件为仪器自带的CXP分析系统,动态血沉仪购自北京普利生公司,IMMAGE800购自美国Beckman Coulter公司,XN-10型仪器购自日本 Sysmex公司。
1.3 实验方法
1.3.1标本采集及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)提取 分别空腹采集每例HC和SLE患者5 ml 乙二胺四乙酸抗凝外周血,采集当天对抗凝全血标本进行实验检测。按照PBMC Ficoll-Paque分离液操作规程,将收集的新鲜受试者全血、磷酸盐缓冲液、Ficoll-Paque分离液按照三者同等比例混合,常温1 500 r/min离心20 min后缓慢降速至停止,吸出的中间白膜层即为PBMC,采用磷酸盐缓冲液洗涤后重悬,用于后续流式检测。
1.3.2流式细胞术检测PBMC表面分子 各取受试者100 μl 生理盐水重悬的PBMC(2×105)加入3个待测试管中,分别加入以下组合流式检测抗体各10 μl:ECD-CD4、PC7-CXCR5、FITC-IgGl;ECD-CD4、PC7-CXCR5、FITC-PD1;PC5-CD19、PE-CD27、FITC-CD38在4 ℃条件下避光孵育30 min,如有残留的红细胞,则需采用红细胞裂解处理,再生理盐水洗涤,1 500 r/min离心5 min,弃上清液,重悬后用Cytomics FC 500流式细胞仪检测分析,使用自带分析软件分析PD1在CXCR5-CD4+细胞上的表达情况以及浆母细胞(CD19+CD27+CD38+)的比例。
1.3.3SLE的其他实验室指标检测 采用动态血沉仪法检测红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR);采用速率散色比浊法检测C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)、补体C3(complement 3, C3)和补体C4(complement 4, C4);采用间接免疫荧光法检测ANA和anti-dsDNA,采用线性印记法检测anti-Sm、anti-SSA、anti-SSB、anti-Ro52、anti-Histone、 anti-AnuA、anti-Rib-P;采用XN-10型仪器检测血常规指标,获取白细胞计数(white blood cell, WBC)、血小板计数(platelet, PLT)、淋巴细胞计数(lymphocyte, L)、淋巴细胞百分比(percentage of lymphocyte, L%)、单核细胞计数(monocyte, M)、单核细胞百分比(percentage of monocyte, M%)、中性粒细胞计数(neutrophil, N)、中性粒细胞百分比(percentage of neutrophil, N%)、血红蛋白(hemoglobin, HGB)、血细胞比容(hematocrit, HCT),并根据这些指标计算LMR(L/M)、NLR(N/L)、PLR(PLT/L)、SII(PLT×N/L)、dNLR[N/(WBC-N)]、MNR(M/N)、PMR(PLT/M)、PNR(PLT/N)。
2.1 PD1在SLE患者和HC外周血CXCR5-CD4+T 细胞的表达水平SLE患者PD1+CXCR5-CD4+T 细胞百分率[(25.27±12.65)%vs(17.75±8.42)%]高于HC,差异有统计学意义(P=0.008 3,U=540.5),见图1B;SLE 患者CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI[(2.23±0.57)vs(1.61±0.22)]高于HC,差异有统计学意义(P<0.000 1,U=187.0),见图1C。
2.2 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T 细胞PD1表达水平与疾病活动性指标、浆母细胞比例相关将反映SLE患者疾病活动性指标(SLEDAI、ESR、CRP、WBC、红细胞(red blood cell,RBC)、HGB、HCT、PLT、L、L%、M、M%、N、N%、NLR、PLR、LMR、dNLR、SII、MNR、PMR、PNR、IgG、C3、C4、ANA、anti-dsDNA、anti-Sm、anti-SSA、anti-SSB、anti-Ro52、anti-Histone、anti-AnuA、anti-Rib-P、治疗、关节炎、皮疹、脱发、浆膜炎、口腔溃疡、肾脏损伤等)与CXCR5-CD4+T 细胞PD1表达水平进行相关性分析。结果显示,PD1+CXCR5-CD4+T 细胞百分率与C3呈负相关,与LMR有负相关的趋势,但差异无统计学意义,见表1。PD1+CXCR5-CD4+T 细胞百分率在anti-SSA、anti-Histone阳性的SLE患者高于阴性者,治疗后PD1+CXCR5-CD4+T 细胞百分率低于治疗前,见表2;并未发现PD1+CXCR5-CD4+T 细胞百分率与其他指标相关;CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI与SLEDAI、ESR、CRP、N%、NLR、dNLR呈正相关,与RBC、HGB、HCT、L、L%、LMR呈负相关,见表1。CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI在anti-SSA阳性的SLE患者有高于阴性者的趋势,但差异无统计学意义,CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI在anti-Ro52阳性的SLE患者高于阴性者,治疗后CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI低于治疗前,CXCR5-CD4+T 细胞PD1表达的MFI在肾脏损伤SLE患者有高于阴性者的趋势,但差异无统计学意义,见表3;并未发现CXCR5-CD4+T 细胞PD1表达的MFI与其他指标相关。
表1 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T细胞PD1的表达与疾病活动性指标、浆母细胞比例相关性分析
表2 SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T 细胞百分率与疾病活动性指标的关系
表3 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T 细胞PD1表达的MFI与疾病活动性指标的关系
自身抗体的产生与B细胞转化为浆母细胞(CD19+CD27+CD38+)的能力有关,进一步分析SLE患者外周血CXCR5-CD4+T细胞PD1表达水平与浆母细胞比例的关系发现,SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T细胞百分率、CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI均与浆母细胞比例呈正相关,见表1。
表4 纳入PD1+CXCR5-CD4+T细胞百分率、CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI的方程
2.4 CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI和常规实验室指标对SLE的预测价值采用ROC评估CXCR5-CD4+T细胞PD1表达水平对SLE的预测价值,结果显示PD1+CXCR5-CD4+T细胞百分率、CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI、联合PD1+CXCR5-CD4+T细胞百分率和CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI预测SLE的AUC分别为0.671、0.886、0.878,敏感度分别为36.17%、87.23%、65.96%,特异度分别为97.14%、77.14%、97.14%,见图2、表5。
表5 外周血CXCR5-CD4+T 细胞PD1表达水平对 SLE患者的预测效能
图2 外周血CXCR5-CD4+T 细胞PD1表达水平对 SLE患者的预测作用
如表6所示,SLE患者与HC的常规实验室指标中,RBC、HGB、HCT、PLT、L、L%、M%、N%、NLR、PLR、LMR、dNLR、SII、PMR、PNR在两组之间存在差异(P<0.05)。ROC曲线分析这些差异常规实验室指标对SLE的预测价值发现,RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR的AUC大于0.800。由于标本量不够大,本研究选择SLE的危险因素CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI和AUC大于0.800的常规实验室指标(RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR)进行单因素和多因素分析,筛选出可用于SLE预测建模的指标,如表7所示,CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI和HGB用于预测建模。根据逻辑回归系数,本研究构建的SLE预测模型为:P=8.41×CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI-0.27×HGB+19.80,P值为预测数值。计算各个样本的预测数值,SLE患者的预测数值[(9.17±9.07)vs(-3.86±2.39)]高于HC(P<0.000 1,U=35.0),见图3A。采用ROC曲线分析预测模式对SLE的预测价值,发现Cut-off值为-0.204时,其AUC、敏感度、特异度分别为0.979、95.74%、97.14%,见图3B。且预测模式与SLEDAI呈正相关(rs=0.313 6,P=0.030 3),见图3C。
表6 SLE患者和HC常规实验室指标特点和指标预测价值
表7 单因素和多因素分析与SLE相关的危险因素
图3 基于CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI和HGB预测模式的预测价值
外周辅助性T细胞(PD1+CXCR5-CD4+T)是近年来新发现的一群CD4+T细胞亚群,其可促进B细胞向浆细胞转化和致病性自身抗体的产生[3-4]。国外学者Bocharnikov et al[6]和国内学者[5, 7]的报道均表明PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例在SLE的发生发展中发挥着至关重要的作用。但关于PD1+CXCR5-CD4+T细胞上PD1表达MFI与SLE的关系却鲜为报道。本研究对SLE患者和HC外周血PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI进行检测,结果显示两组外周血PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI均不相同,SLE患者PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI显著高于HC,且随着疾病活动度的增加而升高;在抗体阳性患者组,PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI均高于对应阴性组,提示PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例越高、PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI越高,患者体内的自身抗体越多,SLE病情越活跃。进一步研究分析发现,PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI均与促进抗体产生的浆母细胞比例呈正相关。此外,SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI均与SLE治疗相关,治疗缓解后PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI均下降。这些关于SLE患者中PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例的研究结果与相关研究[5-7]是一致的。此外,本研究结果还表明PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI越强,产生的自身抗体越多、SLE患者活动性和疾病严重程度越高。这与张力 等[14]关于滤泡辅助性T细胞上PD1表达可以作为评估自身免疫病疾病严重程度和活动性指标相一致。
虽然PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI均与SLE患者活动性和疾病严重程度相关,但PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI与更多的SLE患者活动性和疾病严重程度指标(SLEDAI、ESR、CRP、RBC、HGB、HCT、L、L%、N%、NLR、LMR、dNLR)相关,表明PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI可能在SLE致病中所起的作用更强。且进一步逻辑回归分析上调的PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例、CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI是否为SLE的发病危险因素,结果表明上调的CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI是SLE发病的危险因素,而PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例并不是。这些研究结果表明PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达强弱在SLE致病中起主导作用。
近年来,有学者致力于探讨免疫细胞以及免疫细胞结合常规指标对免疫相关性疾病的预测价值[10, 15-16]。本研究采用ROC曲线分析PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例、CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI、联合两者对SLE的预测价值发现,CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI的AUC最高(0.886),敏感度和特异度分别为87.23%、77.14%。
此外有研究[11]表明血常规以及相关比值等指标可用于疾病以及疾病严重程度的预测,考虑到SLE患者血常规指标存在异常,并且血常规指标是简便、低廉、易获取的指标,本研究分析这些指标对SLE的预测价值发现,RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR的AUC大于0.800。进一步采用单因素和多因素分析筛选CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI、RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR是否为SLE相关危险因素时,发现CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI和HGB是其危险因素。本研究将CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI和HGB纳入SLE预测模型,升高的预测数值对SLE具有明显的预测作用,其AUC、敏感度、特异度分别为0.979、95.74%、97.14%,并且与SLE疾病活动性明显相关。这些结果表明包含CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI和HGB的预测模型不仅可以用于SLE的预测,还可以用于疾病活动性的评估。
此外,本文还存在一些不足之处:一是标本量太少;二是未探讨SLE预测模型在疾病对照组中的数值以及区分SLE与其他疾病的能力。
综上所述,SLE患者升高的外周血PD1+CXCR5-CD4+T细胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI与疾病严重程度及活动性相关,升高的PD1+CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI是SLE的危险因素,基于CXCR5-CD4+T细胞PD1表达MFI和HGB的SLE预测模型既可以用于SLE的预测,也可以用于疾病活动性的评估。但仍需进一步探讨SLE预测模型在SLE预测及疾病活动性评估中的作用。
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