薛小春， 陆翠华， 田尧
(1.南通大学医学院，江苏省南通市226001；
2.南通大学附属医院消化内科，江苏省南通市226001；
3.海安市人民医院，江苏省海安市226600)
结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，对结肠癌分子机制研究的不断进展将有助于寻找新的治疗方法。胶质瘤相关癌基因蛋白(glioma associated oncogene proteins,GLI)是C2H2-Kruppel型转录因子[1]，特定同源物和细胞环境存在4种GLI蛋白(GLI1、GLI2、GLI3和GLI4)，可作为基因表达激活剂或阻遏物[2]。GLI介导的转录调控与GLI蛋白作为Hedgehog(HH)信号通路的下游效应器所发挥的作用有关，也称为HH/GLI信号通路[3]。GLI1通过HH的非典型上调和/或激活是多种癌症的致癌驱动因素，包括结肠癌[4]。但是，同为GL1家族的GLI4在癌症中的作用尚不明确。基于此，本研究旨在探讨GLI4在结肠癌中的表达及对癌细胞生物学行为的影响。
1.1 入选病例
纳入2019年10月—2021年10月本院收治的结肠癌患者160例，其中男94例，女66例，年龄(69.15±25.07)岁。所有患者术前未接受任何治疗，组织被采集后快速冷冻在液氮中，-80 ℃保存。所有患者均病理确诊，并签署知情同意书。本研究方案经本院伦理委员会批准。
1.2 试剂和仪器
GLI4哺乳动物过表达质粒和siGLI4均由南京金斯瑞设计合成。Lipofectamine 3000购自广州瑞舒生物科技有限公司。SYBR-green IMaster Mix购自Thermo公司。N-cadherin、E-cadherin、NANOG、OCT4、GAPDH抗体购自Abcam公司。GLI4抗体购自Sigma公司。
白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)ELISA试剂盒购自北京冬歌博业生物科技有限公司。IL-5 ELISA试剂盒购自北京奇松生物科技有限公司。IL-6 ELISA试剂盒购自北京依珊汇通科技有限公司。IL-10 ELISA试剂盒购自安徽泽升科技有限公司。TRIzol试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。Cell Counting Kit-8购自广州宝汇生物科技有限公司。
1.3 细胞培养与处理
结肠癌细胞LoVo、SW1116购自Procell公司。结肠癌细胞LoVo、SW1116于37 ℃、5%CO2在含有10%胎牛血清的RPMI-1640中培养。将GLI4哺乳动物过表达质粒和siGLI4用Lipofectamine 3000转染LoVo或SW1116细胞中48 h后进行以下实验。
1.4 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR检测结肠癌细胞GLI4、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 mRNA相对表达水平。转染GLI4过表达质粒后，利用TRIzol从SW1116细胞中提取总RNA，并反转录cDNA。采用SYBR-green IMaster Mix进行qRT-PCR检测。使用2-ΔΔCt计算基因表达，并通过GAPDH归一化进行定量。GLI4-F：5′-GGAGTCAACTTCGGTCGGAG-3′，R：5′-TCAGGA GCAGCGAGTTATACT-3′；
GAPDH-F：5′-TGTGGGC ATCAATGGATTTGG-3′，R：5′-ACACCATGTATTCC GGGTCAAT-3′；
IL-4-F：5′-GCCAAGACCCCTTCG AGAAAT-3′，R：5′-CCGATCCTGTTATCTGCCTCC-3′；
IL-5-F：5′-ATCATCGTGGCGCATGTATTAC-3′，R：5′-AAAGAACTTGAGCCAAACCAGT-3′；
IL-6-F：5′-GAA GAGCGCCGCTGAGAAT-3′，R：5′-GTGCAGAGGGTTTAATGTCAACT-3′；
IL-10-F：5′-TACCACCTCCCGAA AATGTCA-3′，R：5′-CCCAGTCTGAATGCTCATCTG-3′。
1.5 TCGA数据收集和分析
从TCGA(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)数据库下载结肠癌表达谱。本研究收集87个样本的htseq计数和每千碱基外显子每百万reads mapped(FPKM)的片段，检索患者人口学信息和生存终点。利用DEseq2分析GLI4在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达差异。当错误发现率(FDR)调整P<0.05时，log(fold-change)>1.0或<-1.0分别被定义为下调或上调基因。
1.6 免疫组织化学
免疫组织化学检测结肠癌组织和癌旁正常组织GLI4蛋白表达水平。包埋组织切片，65 ℃脱蜡4 h，放置在0.3%过氧化氢和甲醇溶液中30 min。磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤后，组织切片样品与GLI4一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜，室温下生物素化二抗孵育20 min。阴性对照用另一个芯片中的稀释缓冲液代替一抗。PBS洗涤后，DAB中孵育5 min，进行免疫染色。洗涤后，用乙醇和二甲苯脱水，用永久培养基固定，显微镜下观察，根据染色深度判断GLI4表达水平。
1.7 酶联免疫吸附实验
按照说明书操作，用ELISA IL-4、IL-5、IL-6和IL-10试剂盒分别测量结肠癌细胞LoVo和SW116上清中IL-4、IL-5、IL-6、IL-10含量。使用自动酶标仪ELX 808IU在450 nm处读取光密度。使用二次曲线拟合分析结果。
1.8 细胞增殖的测定
结肠癌LoVo或SW1116细胞增殖由Cell Counting Kit-8确定。将细胞以2×103个/孔接种于96孔板，处理结肠癌细胞后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h，按照说明操作，在570 nm处测量光密度。
1.9 免疫印迹
LoVo或SW1116细胞用裂解缓冲液在冰上裂解，裂解液在12 000×g条件下离心15 min。BCA试剂盒用于评估蛋白水平。蛋白经SDS-PAGE处理，转移至PVDF膜。一抗和二抗按顺序孵育膜。利用ECL检测系统对蛋白质条带进行可视化检测。使用ImageJ计算蛋白质条带的灰度值，结果以灰度值显示。
1.10 转录组测序和免疫浸润分析
利用TRIzol试剂从结肠癌组织中抽取RNA，由诺禾致源公司进行RNA转录组测序并分析免疫细胞分子标志物；
根据测序结果中免疫细胞分子标志物的表达水平检测GLI4表达与CD56brightNK细胞等免疫细胞浸润的相关性。
1.11 统计学分析
2.1 GLI4在结肠癌的表达水平和对预后的影响
TCGA数据库中结肠癌患者基于不同GLI4表达组的Kaplan-Meier生存分析，GLI4高表达患者的中位生存期低于低表达患者(图1A)。在TCGA(图1B)和本研究(图1C)队列中，GLI4在结肠癌组织中的表达均高于癌旁正常组织,本研究队列中GLI4表达与淋巴结转移和分期具有相关性(P<0.05；
表1)。
图1 GLI4在结肠癌的表达水平和对预后的影响
表1 不同表达水平GLI4与结肠癌患者临床特征的关系(n=80) 单位：例(%)
2.2 GLI4促进结肠癌细胞增殖、上皮间充质转化能力和干性
结肠癌细胞LoVo和SW1116增殖在过表达GLI4后上升，在敲低GLI4后下降(P<0.05；
图2)。结肠癌细胞LoVo和SW1116的E-cadherin水平在过表达GLI4后下降，在敲低GLI4后升高；
N-cadherin则与E-cadherin相反；
提示GLI4的敲低阻断了上皮间充质转化过程(P<0.05；
图2)。过表达GLI4后，结肠癌细胞LoVo和SW1116的NANGOG和OCT4在过表达GLI4后上升，在敲低GLI4后下降，提示GLI4的敲低减少了结肠癌细胞的干性(P<0.05；
图2)。
2.3 GLI4促进CD56bright NK细胞抑制因子的分泌
将免疫浸润中的免疫细胞与GLI4表达水平进行相关性分析发现，CD56brightNK细胞数与GLI4的表达水平呈正相关(图3A)。结肠癌细胞LoVo和SW1116中CD56brightNK细胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10在过表达GLI4后上升，在敲低GLI4后下降(图3B)。
图3 GLI4促进CD56bright NK细胞抑制因子的分泌
在全球癌症发病率和死亡率排名中，结肠癌分别位列第三位和第四位[5]，每年有超过100万新的结肠癌病例和大约60万人死于结肠癌[6]。结肠癌的发生和发展涉及多种因素，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活[7]。由于抗肿瘤治疗方法的改进，近几十年来，每年的死亡人数正在逐渐减少[8]。遗传和表观遗传的改变被认为与结肠癌恶化密切相关[9]。据预测，结肠癌的死亡率将在2035年前不断攀升[10]。对结直癌分子机制的不断探讨将有助于寻找新的治疗方法。
本研究通过分析TCGA数据库发现GLI4高表达结肠癌患者的中位生存期明显低于低表达患者。在TCGA数据库的队列和本研究队列结肠癌患者中，GLI4在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。此外，GLI4的表达水平与淋巴结转移(N)分期具有相关性。因此，GLI4的表达水平可以作为结肠癌预后的潜在生物标志物。
本研究发现，过表达GLI4后结肠癌细胞LoVo和SW1116增殖、上皮间充质转化能力和干性水平上升。GLI介导的转录调控与Hedgehog(HH)信号通路的下游效应器所发挥的作用有关，也称为HH/GLI信号通路，GLI蛋白是Hedgehog(Hh)信号传导的效应物，在胚胎发育期间参与许多细胞增殖和分化等过程，GLI转录因子具有DNA结合锌指结构域，其结合靶基因上的共有序列以启动或抑制转录[11]。有研究结果表明，转录因子GLI1在卵巢上皮癌中表达水平显著高于卵巢正常上皮组织,在卵巢上皮癌中表达水平显著高于卵巢上皮良性肿瘤,其在卵巢上皮癌细胞的高表达可能参与促进了卵巢癌的发生发展,推测转录因子GLI1可能作为卵巢上皮癌的治疗靶点[12]。有研究发现，口腔鳞状细胞癌病变过程中HH通路被异常激活，GLI2在该通路活化过程中发挥重要作用[13]。干扰GLI2表达可抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、生长、迁移和侵袭。GLI2通过调控HH通路下游细胞迁移和侵袭标志基因及蛋白的表达而影响口腔鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭。GLI3在肝内胆管细胞癌组织中表达较癌旁正常组织表达上调,并同肿瘤组织的肿瘤分化程度、淋巴结转移、血管浸润和肿瘤TNM分期密切相关。GLI3过表达可能与肝内胆管细胞癌的发生、发展、肿瘤侵袭及转移行为有关,有望成为肝内胆管细胞癌的潜在的肿瘤靶标或预后评估指标[14]。因此，抑制GLI介导的转录激活可以成为治疗各种人类恶性肿瘤的潜在的化疗策略。
NK细胞可以根据CD56的相对表达细分为不同的亚群[15]。CD56brightNK细胞被认为是具有免疫调节特性的有效细胞因子生产者，在抗感染和抗癌防御中起关键作用[16]。考虑到CD56brightNK细胞具有肿瘤杀伤作用，并且促癌因子GLI4的表达水平与其数量呈正相关，因此本研究检测了GLI4是否促进CD56brightNK细胞抑制因子的分泌。本研究过表达GLI4后，结肠癌细胞LoVo和SW1116中CD56brightNK细胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌水平上升。因此，即使在结肠癌组织中浸润了很多CD56brightNK细胞，GLI4也可以促进相关细胞因子分泌来抑制CD56brightNK细胞的抗肿瘤功能。
综上所述，高GLI4表达与结肠癌患者的癌症进展和中位生存期显著相关。GLI4可以促进结肠癌细胞的增殖水平、上皮间充质转化能力和干性水平。此外，GLI4可以促进CD56brightNK细胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的表达。
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