施金荣，周志军，冯璐，岳胜兰，程小玲，张雪婷，胡勇，段凯，李策生
1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430207；
2.国药集团武汉血液制品有限公司，湖北 武汉 430207
新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARSCoV-2）引起的急性感染性肺炎［1］。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计数据显示，截至2022 年4 月4 日，全球489 779 062 人确诊感染SARA-CoV-2，导致超615 万人死亡［2］。根据SARSCoV-2 的传播特征和当今世界的防疫形势，预计SARS-CoV-2 或将长时间在全球范围内与人类共存，且每年均会出现不同的变异株。当前SARS-CoV-2变异株的方向已呈传染性变化不明显、毒性增强（简称为强毒株变异）和传染性增强、毒性减弱（简称为弱毒株变异）两条发展路径。前者以阿尔法（Alpha）、贝塔（Beta）及德尔塔（Delta）变异株为代表，后者目前以奥米克戎（Omicron）变异株为代表。弱毒株变异株Omicron 于2021 年11 月在南非首次报道，与早期传播的SARS-CoV-2相比，其特征是有大量突变［3］。根据初步数据，大多数突变位于刺突（Spike）蛋白，这与大量疾病和疫苗衍生抗体中和作用的逃逸有关，也可能与较低的疫苗有效性有关［4-8］。疫苗免疫后的健康成年人群对Omicron株保留了相当的免疫力，感染后症状有明显向轻症化发展的趋势。针对这部分人群，更有针对性地精准调整防疫措施，才能在确保人民群众生命健康安全的同时降低防控成本。
2022 年3 月，Omicron 在国内快速传播，其传播与病例数量急剧增加以及再次感染风险增加有关［9］。国家针对流行病学数据调整了疫情防控方针，将SARSCoV-2快速抗原检测试剂纳入第九版《新冠肺炎诊疗方案》［10］。在全球范围内，SARS-CoV-2 抗原快速检测已获得广泛认可。截至2022年4月10日，通过WHO紧急使用清单（emergency use list，EUL）［11］、美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）紧急使用授权（emergency use authorization，EUA）［12］及欧洲统一（Conformite Europeenne，CE）认证［13］的抗原检测试剂盒分别有5、48和203款。而我国国家药品监督管理局也紧急开放免临床实验申报SARSCoV-2 快速抗原检测试剂的申报通道，至今已有23家产品获得国家医疗器械许可证［14］。基于目前实验室检测SARS-CoV-2 积累的经验和常见问题，并结合国内外最新研究进展和应用实践，中国医院协会临床微生物实验室专业委员会组织相关领域专家共同制定了《新型冠状病毒抗原快速检测专家共识（2022）》［15］。明确了目前SARS-CoV-2抗原快速检测方法的性能特点，可为不同场景下的快速抗原检测应用、结果解读及处置提供技术支撑，促进疫情防控中抗原快速检测的专业化、规范化和标准化。
本研究利用武汉生物制品研究所有限责任公司（以下简称武汉所）拥有部分SARS-CoV-2 变异株的优势，对国内外部分厂家的SARS-CoV-2 抗原快速检测卡检测不同病毒株的灵敏度进行了评估，以期促进我国SARS-CoV-2 抗原检测试剂的高质量、快速发展。
1.1 SARS-CoV-2抗原快速检测卡、核酸检测试剂及疫苗原液 17个厂家SARS-CoV-2抗原快速检测卡的基本信息见表1；
RNA 提取试剂QIAamp Viral RNA Mini Kit（批号：166012741）购自德国QIAGEN GmbH公司；
SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法，批号：nCOV20210302）购自上海捷诺生物科技有限公司；
SARS-CoV-2 灭活疫苗原液由武汉所质量控制室提供，包括原始株原液（病毒滴度：7.8 lgCCID50／mL）、Beta 株原液（病毒滴度：7.3 lgCCID50／mL）、Delta 株原液（病毒滴度：7.2 lgCCID50／mL）、Omicron 株原液（病毒滴度：7.6 lgCCID50／mL）。
表1 SARS-CoV-2抗原快速检测卡的关键参数Tab.1 Key parameters of SARS-CoV-2 antigen-detecting rapid diagnostic cards
1.2 抗原快速检测卡检测原理及结果判定 抗原快速检测卡检测原理为双抗体夹心法［16］，虽然不同厂家的裂解液体积、上样体积及反应时间各有不同，但结果判定标准一致，即C 线和T 线均有显色条带，判为阳性；
若C线有显色条带，T线无显色条带，判定为阴性；
若C 线、T 线均无显色条带，或仅有检测线显色，表明试纸已失效，结果无效。
1.3 核酸检测原理及结果判定 核酸检测原理参考文献［17］。TEXAS RED 通道为ORF1ab，FAM 通道为核壳蛋白（N）基因，两者Ct＜37 时判为阳性，无Ct或Ct≥37时判为阴性；
同一份样本的ORF1ab和N同时判为阳性，则该样品判为阳性，若仅有1 个通道为阳性，则需复试，复试结果中仍仅有1 个通道为阳性，则判为阳性。
1.4 SARS-CoV-2 抗原快速检测卡对不同病毒株的灵敏度检测 按照各厂家说明书操作，即咽拭子（默认100 μL）和裂解液（300 ～500 μL）按反应比例制备出原始混合样品，如10 μL SARS-CoV-2 病毒株原液与30 ～50 μL裂解液混合后，振荡器混匀1 min，即为原倍稀释样品，再用各厂家对应的裂解液继续10 倍系列稀释，如30 μL 原倍稀释样品加270 μL 裂解液，依次稀释为10-1～10-5，用相应厂家的抗原检测卡进行检测；
以出现阳性结果的最高10 倍稀释度为起点，再进行2 倍系列稀释，用相应厂家的抗原检测卡进行检测，观察C 线和T 线的显色情况，以能观察到阳性结果的最高稀释度作为该测试卡的最低检测限，在最低检测限的浓度重复检测3次。
1.5 不同病毒株原液的核酸灵敏度检测 将不同SARS-CoV-2 病毒株原液用生理盐水10 倍梯度稀释（10-1～10-10），用RNA 提取试剂提取不同稀释度样品的RNA，通过核酸检测试剂盒进行扩增检测，以能观察到阳性结果的最高稀释度作为核酸检测试剂的灵敏度。每份样本均设3个复孔。
1.6 数据分析 根据稀释度评价抗原快速检测卡、核酸检测试剂的灵敏度，将抗原快速检测卡与核酸检测试剂检测结果对应的稀释度进行比较，判断稀释度最大即灵敏度最高1 组抗原快速检测试剂对应的核酸检测N基因Ct值。
2.1 SARS-CoV-2 抗原快速检测卡检测不同SARSCoV-2病毒株的灵敏度 SARS-CoV-2抗原快速检测卡检测原始株、Beta 株、Delta 株和Omicron 株疫苗原液的灵敏度分别为1∶10 ～1∶8×104、1∶103～1∶2×105、1∶102～1∶4×104、1∶10 ～1∶4×105，结果显示，国内外17 个厂家21 批次的SARS-CoV-2 抗原快速检测卡对Omicron株疫苗原液的灵敏度差异极大，除厂家11-1 批外，最大差异可达1 000 倍；
除厂家9（一体式）外，国内厂家对非Omicron 株疫苗原液的灵敏度最大差异在10 ～100 倍之间。提示部分厂家的试剂质量还有较大提升空间。见表2。
表2 不同厂家抗原快速检测卡检测不同病毒株的灵敏度（稀释倍数）Tab.2 Sensitivity（dilution）of antigen-detecting rapid diagnostic cards from different manufacturers in detecting different virus strains
2.2 SARS-CoV-2原液的核酸检测灵敏度 原始株、Beta 株、Delta 株、Omicron 株疫苗原液核酸灵敏度分别为10-6、10-5、10-4、10-7，见表3。
表3 核酸检测试剂检测不同SARS-CoV-2病毒株的灵敏度（Ct）Tab.3 Sensitivity of nucleic acid detection reagent to different SARS-CoV-2 variants（Ct）
根据稀释度对比抗原快速检测卡最高灵敏度与核酸检测试剂灵敏度，除Beta 株和Delta 株灵敏度接近外，原始株和Omicron 株的灵敏度至少低100 倍，总体来说抗原快速检测卡的灵敏度低于核酸检测试剂。高灵敏度的抗原快速检测卡能达到核酸检测的N基因的Ct值分别为：原始株（10-4）＞31，Beta 株（10-5）＞36，Delta 株（10-4）＞34，Omicron 株（10-5）＞33，达到国内与CE 对SARS-CoV-2 抗原快速检测试剂的要求，见表4。
表4 抗原快速检测卡最高灵敏度与核酸检测试剂灵敏度的对比Tab.4 Comparison of the highest sensitivity of antigen-detecting rapid diagnostic cards and sensitivity of nucleic acid detection reagent
根据SARS-CoV-2 数据库GISAID 目前共享信息，SARS-CoV-2 Omicron 变异株的突变位点数量明显多于近2 年流行的所有SARS-CoV-2 变异株，其在病毒Spike 蛋白突变多达15 处，包括K417N、S477N、T478K、E484A、N501Y、G339D、S371L、S373P、S375F、N440K、G446S、Q493R、G496S、Q498R 和Y505H 中E484A、K417N等与免疫逃逸相关的突变可能具有很强的耐药性和免疫逃逸能力［18-19］。但对Omicron 变异株的基因组分析显示，其突变位点不影响我国主流核酸检测试剂的敏感性和特异性。Omicron 变异株突变位点主要集中在S 蛋白基因的高变异区，并不位于我国第八版《新型冠状病毒肺炎防控方案》公布的核酸检测试剂引物和探针靶标区域（中国疾病预防控制中心病毒病所向全球公布的ORF1ab和N基因）［20］。目前SARS-CoV-2抗原检测卡靶标主要针对的是N蛋白，结果显示，大部分厂家产品对Omicron变异株均有反应，只是灵敏度差异较大（10-1～10-5），表明可能所用的单抗针对的N 蛋白位点不同，其中11号公司早期测试卡1针对非Omicron变异株反应性较强（10-4），而对Omicron 变异株基本无反应（10-1）即说明了该点，提示部分厂家需重新选择对Omicron株反应性更强的单抗来提高灵敏度，适应当前Omicron株为主要流行株的特点，避免漏检。同时建议11 号公司可用测试卡1（对Omicron 株基本无反应）和测试卡2（对4株病毒均有较强反应）组成Omicron 分型试剂，即2 个测试卡均是阳性即为Omicron 株，测试卡1 阳性，测试卡2 阴性，即为非Omicron 株，这在流行病调查和疫情精细防控中能起到很大作用，可对不同病毒株感染者分流进行差异性管理。
本研究还发现，有的厂家产品偶尔会在检测限附近的稀释度出现反勾现象（阴性成立），即低浓度样品T线浓于高浓度或在两个相邻10倍系列稀释度出现浓淡一致的现象，而不是理论上T 线浓淡与稀释度呈正相关的现象。分析原因，一方面可能是厂家为了追求灵敏度而将裂解液的pH 调至胶体金结合的临界点，导致抗体与胶体金分离引起的；
另一方面可能是大批量制备抗体划线不均一所致，这也提示厂家在产品上市后一定要注重质量稳定性。
在用核酸检测试剂盒检测的结果中，抗原快速检测试剂对某些病毒株的灵敏度接近或超过核酸检测，原因可能是核酸采用10 倍系列稀释，每10 倍之间产生Ct值的差异达3.3，无法确定其真实的灵敏度，与抗原检测相似，越是检出限附近的，越应采用低的稀释倍数，这样才能确定其灵敏度；
同时，还与选择的核酸检测试剂本身有关，如试剂本身灵敏度较差，检测结果会造成不准确的判断。但从理论上来说，由于受检测的方法学限制，核酸试剂的灵敏度比一般的抗原试剂高100 ～1 000倍，部分优质的抗原试剂可能差距没这么大。中国香港疫情研究显示，对于核酸检测（RT-qPCR）Ct值低于25 的人群，高品质的快速抗原检测具有接近100%的灵敏度和特异性，因此，在感染较多的环境下，试剂质量非常重要［21］。
由于各抗原检测卡生产厂家难以获得不同时期不同变异株的样品来进行其质量的监测，以了解其对各种流行株的检测覆盖度和灵敏度，本研究开展了该次评估工作。由于疫苗原液（2次灭活）比病毒培养上清（未灭活或1 次灭活）安全性更高，理论上病毒滴度是活病毒感染细胞产生病变的结果，对应的至少是结构完整的病毒颗粒，与原液所包含的纯化病毒颗粒更加对应，作为平行比对样品比培养上清更有优势，假设稳定工艺对应与病毒影响是同等的，本研究进行平行比较也可以TCID50对厂家检测灵敏度进行赋值比较。目前本研究对不同病毒株的灵敏度评估结果与国外报道一致［22］，结果显示，部分高品质国产试剂的灵敏度优于美国Abbott 产品。由于国内厂家对非Omicron 株的灵敏度差异低于Omicron株，提示国内厂家应持续关注并评估SARS-CoV-2 变异株的出现及其对试剂检测效果的影响，对存在影响的，进一步研究如何改进对不同变异株的检测效果，从而为疫情防控提供更优的工具。同时，部分厂家根据本次初次评估结果重新进行了优化，重新送样结果显示，灵敏度大幅提升，表面好的评估系统能促进厂家提高产品质量。
2022 年3 月14 日，国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布了《新型冠状病毒抗原检测试剂注册技术审评要点（试行）》［23］，抗原检测试剂注册标准大幅提高。重要的一项变化在于，2022 版新规对检测试剂的Ct值作出了规定，要求临床试验的阳性样本中不同病毒载量样本应分别具有足够的样本量：以核酸检测试剂阳性判断值Ct≤38 为例，建议Ct≤30 的阳性样本例数不低于170 例，Ct＞30 的阳性样本例数不低于30 例。CE 对抗原快速检测试剂审批条件为［24］：Ct在17 ～36 之间，包括极高的病毒载量（Ct值17 ～25，约占总数的40%合并临床标本数）、高病毒载量（Ct值25 ～30，约占总数的40%汇集的临床标本）和病毒载量中等（Ct值30 ～36，约占总数的20%合并临床标本数）。综合分析，Ct值30是评估SARS-CoV-2 抗原快速检测试剂的分界线。Ct值是核酸检测中的一个指标，能够衡量样本病毒浓度高低，Ct值越高，则病毒浓度越低。香港大学李嘉诚医学院生物医学学院教授金冬雁表示，一般Ct值在15以下的感染者有超级传播风险，Ct值在21以上仍有传播性，达到30 以上基本无传播性，因此，Ct值30 也是一个安全的基准线。目前评估的国内试剂的灵敏度显示，灵敏度高的抗原快速检测试剂基本能达到针对N基因序列的Ct值。
全国体外诊断网（China Association of In-Vitro Diagnostic，CAIVD）反映的多个案例显示［25］，与核酸检测相比，抗原自测试剂有时能更早地检测出阳性感染者；
一些抗原自测为阴性的标本，核酸初检为阳性，复检后为阴性；
而操作不当，或不按照说明书操作会导致抗原自测假阳性或假阴性的发生。上述抽样结果从一个角度反映出高质量的抗原检测试剂有时较核酸检测更准确，应在疫情防控中发挥重要作用。而定期对国内核酸和抗原检测试剂进行质量评估和公示，有助于国家采购质量好的试剂用于监控追踪，以得到稳定可靠的检测结果，并促进企业和市场的良性发展。