吕林芬，庞胜美，李保良，梁雨萱，段强德
（1.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009；
2.扬州大学 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009；
3.扬州大学 江苏省动物重要疫病和重要人兽共患病防控技术国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009）
仔猪腹泻是全球范围内影响仔猪生产最为常见的胃肠道疾病，包括新生仔猪腹泻和断奶仔猪腹泻（Post‐weaning diarrhea，PWD）。仔猪腹泻在临床主要表现为水样腹泻、体质量减轻、生长迟缓和急性死亡。由于高的感染率和较高的死亡率，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。多种因素可以引起仔猪腹泻，其中病原微生物感染是最主要的因素。病原微生物包括病毒性病原和细菌性病原。病毒性病原主要包括传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和轮状病毒（Rotavirus，RV）；
而细菌性病原菌中最主要的是产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）[1‐2]。菌毛黏附素和肠毒素是ETEC 感染引起仔猪腹泻的2 类主要毒力因子。菌毛黏附素包括F4（F4ab、F4ac 和F4ad 3 个血清型）、F5、F6、F18（F18ab 和F18ac 2 个血清型）和F41，其中以F4ac 最为常见。肠毒素包括热敏肠毒素（LT）和热稳定肠毒素（STa 和STb）[3]。对ETEC 致病机制的研究表明，ETEC 感染致病过程中，菌毛黏附素首先与仔猪小肠上皮细胞上特异性的菌毛受体结合，然后黏附、定植后的菌株通过释放肠毒素引起机体水、电解质紊乱，最终引起仔猪腹泻[1]。
当前，预防ETEC 感染所致仔猪腹泻的主要措施包括在饲料中添加抗生素[4]、喂服特异性菌毛抗体[5]、膳食调节[6]、在饲料中添加益生菌或益生元[7]、通过遗传育种方法选育抗ETEC 猪群[8]等。在饲料中添加抗生素很长一段时间是防治ETEC 感染引起仔猪腹泻的主要措施，但是伴随抗生素的不适当使用和滥用，耐药性问题日益突出，严重威胁环境和公共卫生安全[4]。口服特异性菌毛抗体虽然对仔猪腹泻具有较好的疗效，但是抗体提供的保护只限于饲喂期间，而且大量的饲喂会增加养殖成本[5]。膳食调节和在饲料中添加益生菌或益生元可以竞争性地抑制ETEC 和其他病原菌的生长，在维护仔猪肠道菌群平衡的同时，还能有效提高饲料利用率和机体的免疫力，但是在临床上的确切效果还有待进一步验证[6‐7]。猪群由于遗传背景的不同会表现出对ETEC 的易感性或者抗性。因此，利用遗传育种的方法选育抗ETEC 的品系是预防仔猪ETEC 感染的一种重要策略。但是如何精准鉴定易感性和抗性遗传分子标识、抗性性能能否在种猪群中长期稳定地遗传、育种周期太长等问题决定了该策略在当前仍然有一定的局限性[8]。综上所述，疫苗将是目前预防ETEC 感染所致仔猪腹泻最经济、有效和实用的措施之一。但是，由于ETEC 血清型众多、表达毒力因子的异质性、肠毒素野毒本身的细胞毒性、STa 和STb 肠毒素的弱免疫原性等问题，高效、广谱ETEC 疫苗的研发也面临居多挑战。因此，对当前各种猪用ETEC 疫苗的优缺点、ETEC 疫苗研发面临的主要问题以及高效广谱ETEC 疫苗的研究策略进行综述，旨在为研发防制ETEC 感染引起的仔猪腹泻的高效、新型疫苗提供新思路。
当前，灭活菌苗仍然是临床上用来预防仔猪ETEC 感染引起腹泻的主要疫苗。国内商品化的灭活苗是由中国兽医药品监察所研制的F4、F5 和F6+ETEC 三价全菌灭活苗。该菌苗是将分别表达F4、F5和F6菌毛黏附素的ETEC 菌株接种适宜各菌毛黏附素高效表达的培养基培养，再将培养物用甲醛灭活，加氢氧化铝胶作为佐剂制备而成。妊娠母猪在分娩前40 d和15 d分别免疫1次，每次2～5 mL。新生仔猪可以通过吮吸免疫母猪的初乳而获得被动免疫，从而预防ETEC 引起的新生仔猪腹泻。由美国Elanco 动物保健有限公司所研制的ETEC 四价灭活苗除包含F4、F5、F6 三种血清型的ETEC 菌株外，还增加了F41 血清型的ETEC 菌株，能同时预防这4 种不同血清型的ETEC 菌株感染引起的新生仔猪腹泻。硕腾公司研发的仔猪C 型产气荚膜梭菌病、大肠杆菌病（F4、F5、F6 和F41+ETEC）二联灭活疫苗（利特佳），可以同时预防大肠杆菌引起的新生仔猪腹泻和C型产气荚膜梭菌引起的仔猪红痢。
此外，也有一些研究表明，利用在当地腹泻仔猪流行的ETEC 血清型制备的单价或多价自家灭活苗免疫当地猪场同样也具有良好的免疫保护效果[9‐10]。张鹏[9]从安徽6个地区17家规模化养猪场分离并鉴定筛选出优势血清型ETEC 菌株，选用优势血清型的强毒株和弱毒株分别制备单价灭活疫苗或强毒-弱毒株二价灭活苗，研究结果表明，无论是单价还是二价灭活苗，在小鼠模型中均表现出良好的免疫保护效果。杨德鸿等[10]将从苏北地区21 家规模化养猪场中分离鉴定得到的优势血清型ETEC菌株制备成单价或二价自家灭活苗，研究结果表明，制备的单价灭活苗对感染同种血清型的ETEC小鼠具有100%的免疫保护作用，而二价灭活苗对2种血清型ETEC 菌株均具有很高的保护率，并且对其他血清型ETEC 菌株感染也具有部分保护效果。ETEC 自家灭活疫苗对当地流行血清型的ETEC 菌株感染具有较好的免疫保护效果，但是对不同血清型或者其他地区流行的血清型ETEC 菌株的保护效果较差。目前，还没有商品化的灭活苗用来预防断奶仔猪腹泻，这主要是由于免疫F18ac+ETEC 灭活苗对F18ac+ETEC感染没有良好的保护效果。
ETEC 灭活苗使用的优点在于制备程序简便，疫苗安全性高，免疫原性和稳定性高，储存以及运输方便。但是灭活苗也存在诸多缺点，如疫苗中存在多种与所需免疫保护无关的抗原成分和佐剂，有效抗原含量少，免疫保护效果较一般，不良反应较明显；
接种剂量大，免疫保护期较短，并且需要多次重复接种。此外，全菌灭活苗主要诱发体液免疫，不能产生细胞免疫或黏膜免疫应答。
ETEC 的口服活疫苗主要是从自然界筛选到的自然弱毒或无毒菌株。目前，市售的活疫苗只有美国Elanco 公 司 研 制 的Coliprotec®F4 单 价 和Coliprotec®F4/F18 二价活疫苗。大于18 日龄仔猪，断奶后1 d 通过饮水口服单个剂量的Coliprotec®F4活疫苗（1×108cfu），在免疫后3、7、21 d 进行攻毒保护试验，结果显示，免疫后3 d 的保护效果即达到53%，免疫后7、21 d 的保护效果分别为89% 和100%。可见，单剂量的Coliprotec®F4 活疫苗即对F4+ETEC 感染引起的断奶仔猪腹泻具有良好的免疫保护效果[11]。NADEAU 等[12]研究表明，大于18 日龄的断奶仔猪通过饮水口服免疫Coliprote®F4/F18双价活疫苗[1.6×108cfu（F4），2.8×108cfu（F18）]，在免疫后7、21 d，对F4+和F18+血清型的ETEC 菌株感染的断奶仔猪均具有良好的保护效果。此后，GOODMAN[13]等的临床应用效果调查表明，以上2种疫苗在临床上对断奶仔猪腹泻的保护效果不佳。这可能主要是由于引起断奶仔猪腹泻的病因较多，以及饲喂和管理方式等因素对疫苗的使用效果影响也很大。目前，国内商品化的活疫苗仅有中牧实业股份有限公司生产的仔猪大肠杆菌腹泻K88（F4）-LTB 双价基因工程疫苗。该疫苗重组菌株能够同时表达F4 菌毛和LT 肠毒素的B 亚单位，临床上主要应用于预防F4+ETEC 感染引起的新生仔猪腹泻。免疫程序：在母猪预产期前15～25 d，将每头份疫苗（5×1010cfu）与2 g 小苏打一起拌入精饲料中，空腹饲喂母猪后再常规喂食；
或者于母猪预产期前10～20 d 进行肌肉注射免疫（每头100 亿cfu 活菌，注射剂量为1 mL）。疫情严重的猪场，则需在产前7～10 d再加强免疫1次，方法同上。
目前，除了以上3种商品化的疫苗外，也有多种活疫苗处于研发阶段。HUR 等[14]利用减毒伤寒沙门氏菌同时表达F4ab、F4ac、F5、F6 和F41 菌毛，研究表明，妊娠母猪在生产前10 d 口服该重组菌株对断奶前（<21 d）仔猪的ETEC 感染具有良好的免疫保护效果。与传统的肌肉注射疫苗相比，减毒伤寒沙门氏菌重组ETEC 活疫苗在1 周龄和3 周龄的仔猪中能够诱导更高水平的菌毛黏附素IgG 抗体。但是研究没有评估该候选疫苗是否对21 d 以后断奶仔猪的ETEC 感染同样具有良好的免疫保护效果。除免疫母猪外，研究表明，仔猪免疫表达菌毛黏附素和/或肠毒素的重组菌株对仔猪ETEC 感染也有比较好的保护效果。RUAN 等[15]研究表明，将表达FaeG-FedF-LTA2:B融合蛋白的重组菌株连续2 d 以7.5×109cfu/头的剂量免疫仔猪，能够在仔猪体内同时诱导抗FaeG、FedF 和LT 肠毒素的高水平抗体产生，并且可以有效保护表达K88菌毛和LT肠毒素的ETEC 感染引起的仔猪腹泻。但是该疫苗候选株是否对表达F18 菌毛的ETEC 感染引起的仔猪腹泻具有同样的保护效果还需进一步的研究。LIU 等[16]研究表明，当小鼠以1.0×109cfu 的剂量口服免疫表达LT192-STa13 和LT192-STb 的重组大肠杆菌ER-A和ER-B 时，在小鼠体内能够同时诱导产生高水平的抗LT、STa、STb和F41的抗体，并且诱导的抗体能够有效阻断小鼠感染表达相应毒素的ETEC 菌株。但是这2株疫苗候选株对仔猪是否具有免疫保护效果，以及免疫保护效果如何还需要进一步的验证。
与注射用疫苗需要大剂量、多次免疫不同，ETEC 口服活疫苗往往只需要一次免疫即可诱发全面、稳定、持久的黏膜免疫应答，达到较好的免疫保护效果。更重要的是，口服疫苗可以刺激母猪肠相关淋巴组织（GALT）产生分泌型IgA（sIgA）抗体，该抗体可以通过母猪初乳转移给仔猪[17]。口服免疫也可以有效避免注射免疫给仔猪造成的应激反应。但是口服活疫苗热稳定性相对较差，运输、保存条件要求较高（要求在低温、冷暗条件下运输和储存；
通常制成冻干苗以利于保存），并且存在毒力返强的风险和不易制备成联苗。此外，活疫苗容易受到母源抗体干扰，免疫接种时间选择范围相对较窄。
3.1 基于菌毛黏附素的工程亚单位疫苗
菌毛黏附素介导ETEC 菌株与仔猪肠道上皮细胞的黏附和定植是ETEC 感染的第一步，也是必不可少的一步。鉴于菌毛黏附素在ETEC 致病过程中的重要作用，很多基因工程疫苗是以菌毛黏附素亚单位作为抗原。母猪或者仔猪免疫该类疫苗后，仔猪自身可以主动诱导产生或者通过母乳被动获得针对菌毛黏附素的特异性抗体，抗体可以有效阻断表达相应菌毛黏附素的ETEC 菌株与仔猪小肠上皮细胞的黏附，从而预防仔猪ETEC感染[18]。
表达F4 菌毛的ETEC 是引起新生仔猪腹泻的最主要病原菌。多项研究表明，母猪产前注射接种表达F4 菌毛主要亚单位的疫苗，或饲喂表达FaeG亚单位的转基因植物或益生菌，对新生仔猪的F4+ETEC 感 染 均 具 有 较 好 的 免 疫 保 护 效 果[19‐22]。YAHONG 等[19]报道，母猪在产前6 周和2 周分别免疫纯化的FaeG重组蛋白，在母猪血清和初乳中有高水平的IgG 和IgA 抗体，能有效保护新生仔猪的K88ac+ETEC 感染。另有研究表明，断奶仔猪通过口服免疫F4菌毛亚单位疫苗，在仔猪体内能够诱导针对F4+菌毛的特异性抗体，能有效预防仔猪F4+ETEC 感染引起的PWD[23]。因病原体污染的风险显著降低，利用转基因植物生产的菌毛亚单位疫苗比用传统的工程菌、酵母和哺乳动物细胞生产的菌毛亚单位疫苗更安全[22]。另外，利用转基因植物生产亚单位疫苗成本更低，而且通过口服能有效诱导仔猪的黏膜免疫反应[24]。由于适口性好，苜蓿常用来饲喂猪，也常用作转基因植物的受体。利用转基因植物表达菌毛黏附素亚单位，对表达相应菌毛黏附素的ETEC 感染具有较好的保护效果[25]。前人研究表明，断奶仔猪饲喂表达F4菌毛黏附素主要亚单位的转基因苜蓿能有效预防F4+ETEC 感染引起的断奶仔猪腹泻[20‐21]。利用转基因植物表达菌毛黏附素亚单位安全性高、成本低，但是如何提高目标蛋白的表达量，如何抵抗胃酸对蛋白质的消化作用是当前面临的挑战，这也是目前还没有商品化转基因植物疫苗的原因。
多表位融合抗原（Multiepitope fusion antigen，MEFA）技术是一种基于电脑生物学和结构生物学相结合的新型疫苗构建技术和平台，是将来源于不同种属的菌株或者不同血清型菌株中和（阻断）抗原表位，利用电脑生物学和结构生物学技术整合至一个抗原中，并最大限度地模拟抗原表位本身的免疫原性，从而有利于构建具有广泛保护力的新型多联或多价疫苗[26]。DUAN等[27]利用MEFA技术，分别以F4 菌毛主要亚单位FaeG 和F18 黏附亚单位FedF作为骨架，构建了FaeG-Fim41a-FanC-FasA 和FedF-FasA-Fim41a-FanC 2 种多表位融合抗原蛋白，将多表位融合抗原蛋白混合后通过皮下注射免疫小鼠能诱导产生同时针对F4、F5、F6、F18 和F41菌毛的特异性抗体，并且获得的抗体在体外能有效阻断表达相应菌毛黏附素的ETEC 菌株对仔猪小肠上皮细胞IPEC-1 和IPEC-J2 的黏附。再进一步将2种蛋白质融合构建成FaeG-FedF-FanC-FasAFim41a 多表位融合抗原蛋白，该五价候选疫苗抗原可以在小鼠体内同时诱导针对F4、F5、F6、F18 和F41 这5 种靶向菌毛的特异性抗菌毛中和抗体，并且免疫小鼠血清样品可以有效抑制表达这5种菌毛的ETEC 菌株对仔猪小肠上皮细胞的黏附[28]。因此，上述构建的3 个靶向ETEC 菌毛黏附素的多表位融合抗原蛋白具有作为预防ETEC 感染引起PWD的高效、广谱菌毛黏附素疫苗的潜力。
3.2 基于肠毒素的工程亚单位疫苗
除了菌毛黏附素外，肠毒素也是ETEC 感染过程中的重要毒力因子。因此，利用基于肠毒素为候选抗原的类毒素疫苗诱导针对肠毒素的中和抗体也是预防仔猪ETEC 感染的一个重要策略[29]。但是鉴于肠毒素本身强的细胞毒性、不同种类毒素之间缺乏交叉保护以及ST毒素本身免疫原性差等原因，一直以来基于肠毒素为抗原的疫苗研发困难重重。
肠毒素野毒虽然具有强的毒性，但是将与肠毒素毒性相关的某些关键氨基酸残基位点突变能使其毒性显著降低或者无毒性，并且保留其免疫原性[30‐31]。此外，将ST 毒素与其他免疫原性强的蛋白质融合表达可以增强ST的免疫原性，这表明研发基于ETEC 肠毒素的抗毒素疫苗是可行的[32‐33]。由于不同毒素之间的异质性，虽然基于单一类毒素为抗原的抗毒素疫苗对表达相同毒素的ETEC 感染具有良好免疫保护效果，但是对表达异种毒素的ETEC感染无交叉保护作用。鉴于单一ETEC 菌株常能同时产生2 种或者多种类型肠毒素，基于单一类毒素为抗原的抗毒素疫苗的免疫保护效果往往不佳。最近研究发现，将与细胞毒性相关的A 亚基上的单个或者多个关键氨基酸残基位点突变后，LT肠毒素的毒性显著减弱但是保留了良好的免疫原性[34‐35]。因此，这些LT类毒素不仅可以直接作为抗原制成类毒素疫苗，还可以作为蛋白质载体来增强ST毒素的免疫原性。ZHANG 等[36]以LTR192G类毒素为载体，将STa 和STb 毒素与其融合表达，研究结果表明，该融合蛋白在小鼠体内能同时诱导抗LT、STa和STb 3种肠毒素的中和性抗体。FENG 等[37]利用同源重组的方法构建了能同时表达LT、STa 和STb 3 种肠毒素的减毒重组大肠杆菌（ER-T），研究结果表明，小鼠口服该重组菌株能诱导3 种毒素的高水平IgG 和sIgA 抗体，抗体在体内能中和STa 和STb 的毒性作用。此外，SEO 等[38]的研究结果也表明，将3 个拷贝的STaN12S多肽融合至LT 双突变体（dmLT）构建的3xSTaN12S-mnLTR192G/L211A类毒素融合蛋白免疫小鼠和仔猪，在小鼠和仔猪体内均可诱导高滴度的针对STa 和LT 肠毒性的保护性中和抗体，保护仔猪免受产生这2 种肠毒素的ETEC 菌株感染。基于多种肠毒素的多价类毒素疫苗由于具有更广泛的保护力，其免疫保护效果较基于单一肠毒素的类毒素疫苗的免疫保护效果更好。
3.3 基于菌毛黏附素和肠毒素的广谱工程亚单位疫苗
ETEC 感染引起仔猪腹泻需要菌毛黏附素和肠毒素的共同作用，缺一不可。因此，一种真正高效、广谱的ETEC 疫苗应该同时包含有菌毛黏附素和肠毒素这2 类抗原，这样诱导的抗菌毛黏附素的抗体能有效阻断ETEC 与仔猪肠道上皮细胞的黏附，而同时诱导的抗肠毒素的抗体能有效中和肠毒素的毒性作用，从而起到双重保护效果[39]。目前，我国市售的基因工程疫苗有辽宁益康公司研发的仔猪大肠杆菌病基因工程灭活疫苗（GE-3 株）。该疫苗株能同时表达K88 菌毛、STa 和LT 肠毒素，以5 mL 的剂量，分别在产前30～35 d 和15～20 d 肌肉注射免疫妊娠母猪，对K88ac+ETEC 感染引起的仔猪腹泻具有良好的保护效果[40]。免疫该疫苗只能对仔猪的K88ac+ETEC 菌株感染具有保护力，对其他血清型的ETEC感染无交叉保护力。
此外，ZHANG 等[41]以F4 菌毛黏附素主要亚单位FaeG为骨架，将LT肠毒素和STa肠毒素的B细胞抗原表位嵌合至FaeG 中构建了能同时表达F4菌毛黏附素、LT 和STa 肠毒素的重组菌株。提取重组菌株表达的嵌合菌毛免疫兔子能同时诱导抗F4 菌毛黏附素、抗LT 和STa 毒素的抗体。在另外一项研究中，ZHANG 等[17]将肠毒素融合蛋白SLS（STa-LTBSTb）与F4ac 和F5 菌毛抗原混合免疫母猪，发现这种多价候选疫苗可以在母猪血清和初乳中诱导产生抗菌毛黏附素和肠毒素的多种抗体，并且有效保护仔猪的F4+和F5+ETEC 感染，甚至对F41+ETEC 感染也具有较好的保护效果。此外，LU 等[42]利用MEFA 技术平台构建了同时包含菌毛黏附素（F4 和F18 菌毛黏附素）和肠毒素（LT、STa、STb、Stx2e）的多表位融合抗原蛋白，将该抗原蛋白免疫小鼠不仅能诱导阻断表达F4菌毛和F18菌毛的ETEC菌株与仔猪肠道上皮细胞的黏附，还能诱导针对LT、STa、STb 和Stx2e 4 种毒素的中和抗体，表明其具有作为预防ETEC感染引起PWD的候选疫苗的潜质。
与传统疫苗相比，基因工程疫苗通常只包含病原的某一或者某些抗原成分，无核酸，因而基本无不良反应，安全性更好。此外，其可以同时诱导体液免疫和细胞免疫反应，并且具有容易克隆多个抗原基因研制多价苗等优点。但是基因工程苗制备成本较高，免疫原性较弱，通常需要添加佐剂，是否在体内存在基因重组的风险也有待评估。
虽然疫苗是当前预防ETEC 所引起仔猪腹泻的有效手段，但是当前安全、高效、广谱的ETEC 疫苗研发仍然面临诸多难以克服的挑战，主要包括：（1）ETEC 表达毒力因子（黏附素和肠毒素）的异质性要求高效的疫苗必须能同时诱导针对黏附素和肠毒素的特异性抗体，并且对表达不同黏附素和肠毒素的ETEC 菌株感染具有广泛的保护力[43]。（2）由于肠毒素是ETEC 引起仔猪腹泻的重要毒力因子，因此其必须作为疫苗的重要成分，但是LT、STa和STb野毒均具有强的细胞毒性，不能直接作为安全的疫苗抗原使用[44]。（3）STa和STb肠毒素为短的多肽，免疫原性差，本身直接作为抗原不能诱导机体产生抗STa 和STb 的中和抗体[33]。（4）F18 菌毛作为抗原免疫机体，不能诱导产生针对F18+ETEC 感染的保护性抗体[45]。（5）断奶仔猪的免疫时间点难以选择，免疫时间过早易受到母源抗体的干扰，过迟则起不到免疫保护作用[46]。（6）口服型ETEC 疫苗需要克服胃蛋白酶和胃酸的影响，并且保证抗原能够到达肠上皮细胞处与肠相关淋巴组织中的抗原递呈细胞相互作用[47]。
在当前ETEC 菌株耐药性越来越严重和我国全面“禁抗”的形式下，免疫ETEC疫苗是预防ETEC感染引起的仔猪腹泻最经济和可行的手段[48‐50]。鉴于引起仔猪腹泻的ETEC 菌株血清型众多，以及病原菌本身表达的毒力因子众多和毒力因子异质性的问题，广谱、高效的ETEC 疫苗应该是利用新技术研发的多价疫苗，而且最好是同时包含黏附素抗原和肠毒素抗原的广谱多价菌苗。课题组前期的研究表明，基于MEFA 技术平台构建的多价表位疫苗对不同血清型的ETEC 菌株感染具有良好的免疫保护效果，更重要的是疫苗抗原只包括毒力因子的优势B细胞抗原表位，具有更好的安全性。因此，将来可以利用该技术平台研发新型、高效和广谱的多价ETEC 疫苗。另外，虽然利用分子生物学手段将与毒力相关的关键氨基酸位点突变后，LT 肠毒素和STa 肠毒素的毒性大大降低，但在把肠毒素作为疫苗抗原之前应进一步降低其毒性。
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