吴曙智 葛朝洪 梅传州 陈连国 钟优艳
[摘要] 目的 探讨汉防己甲素对高尿酸血症大鼠血尿酸（uric acid，UA）的影响。方法 将40只SPF级别雄性大鼠按照随机数字表法分成空白对照组、高尿酸血症模型组、别嘌醇模型组、汉防己甲素低剂量模型组和汉防己甲素高剂量模型组，每组8只。用腺嘌呤（200mg/kg）与氧嗪酸钾（250mg/kg）联合饲喂酵母饲料（10g/kg）的方法構建高尿酸血症的大鼠模型，空白对照组喂普通饲料。造模成功后，从第8天起，每天下午给予别嘌呤模型组大鼠灌胃别嘌呤醇（40mg/kg），汉防己甲素低剂量模型组、汉防己甲素高剂量模型组分别灌胃16mg/kg和32mg/kg汉防己甲素，空白对照组与高尿酸血症模型组灌胃同等体积的生理盐水。给药后每周采集大鼠血液检测UA、血肌酐（serum creatinine，Scr）及血尿素氮（blood uric nitrogen，BUN）水平，处死后取肝脏检测黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）和腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）活性。结果 干预1周时，除空白对照组外，各组UA水平均显著升高（P<0.05），造模成功。与高尿酸血症模型组相比，干预2周、3周、4周时，低剂量汉防己甲素组的UA、Scr和BUN水平差异均无统计学意义（P>0.05）；
干预4周时，高剂量汉防己甲素模型组的UA水平显著降低（P<0.05）。干预3周、4周时，高剂量汉防己甲素模型组Scr水平均显著降低（P<0.05），干预2周时，高剂量汉防己甲素模型组的BUN水平显著降低（P<0.05）。与高尿酸血症模型组相比，高剂量汉防己甲素模型组XOD活性显著降低（P<0.05），低剂量汉防己甲素模型组、高剂量汉防己甲素模型组ADA活性均显著降低，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 汉防己甲素对高尿酸血症大鼠有改善效果，可能的机制是其对黄嘌呤氧化酶活性的抑制，但其具体作用机制有待进一步研究。
[关键词] 汉防己甲素；
高尿酸血症；
血尿酸；
黄嘌呤氧化酶
[中图分类号] R589 [文献标识码] A [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.005
Study on the mechanism of tetrandrine to reduce blood uric acid level in rats
WU Shuzhi1， GE Chaohong2， MEI Chuanzhou2， CHEN Lianguo2， ZHONG Youyan3
1.Department of Neurology， Wenzhou Peoples Hospital， Wenzhou 325000， China; 2.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China; 3.Department of Pharmacy， Wenzhou Peoples Hospital， Wenzhou 325000， China
[Abstract] Objective To study the effect of tetrandrine on serum uric acid （UA） in hyperuricemia rats. Methods A total of 40 SPF-rated male rats were divided into blank control group， hyperuricemia model group， hyperuricemia model with allopurinol group， hyperuricemia model with tetrandrine low-dose group and hyperuricemia model with tetrandrine high-dose group according to random number table method， with 8 rats in each group. The rat model of hyperuricemia was constructed by feeding adenine （200mg/kg） with potassium oxyzincate （250mg/kg） in combination with yeast diet （10g/kg）， while the blank control group was fed with normal diet. From day 8 onwards， the rats were given allopurinol （40mg/kg） by gavage in the afternoon every day， 16mg/kg and 32mg/kg of tetrandrine in the low-dose model group and high-dose model group respectively， and the same volume of saline in the blank control group as in the hyperuricemia model. After administration， blood was collected weekly from the rats to test the levels of blood UA， serum creatinine （Scr） and blood urea nitrogen （BUN）， and liver was taken after execution to test the activities of xanthine oxidase （XOD） and adenosine deaminase （ADA）. Results After 1 week of intervention， UA levels were significantly higher in all groups except the blank control group （P<0.05）， and modelling was successful. There was no statistically significant difference in UA， Scr and BUN levels in the hyperuricemia model with tetrandrine low-dose group at 2 weeks， 3 weeks and 4 weeks of intervention compared to the hyperuricemia model group （P>0.05）. At 4 weeks of intervention， UA levels were significantly lower in the hyperuricemia model with tetrandrine high-dose group （P<0.05）. At 3 and 4 weeks of intervention， the Scr level was significantly lower in the hyperuricemia model with tetrandrine high-dose group （P<0.05）. At 2 weeks of intervention， BUN levels were significantly lower in the hyperuricemia model with tetrandrine high-dose group （P<0.05）. XOD activity was significantly lower in the hyperuricemia model with tetrandrine high-dose group compared to the hyperuricemia model group （P<0.05）. The ADA activity was significantly reduced in the hyperuricemia model with tetrandrine low-dose group and the hyperuricemia model with tetrandrine high-dose group， and the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion The ameliorative effect of tetrandrine on hyperuricemia rats. The possible mechanism for the improvement of hyperuricemia in rats is the inhibition of xanthine oxidase activity， but the exact mechanism of action needs to be further investigated.
[Key words] Tetrandrine; Hyperuricemia; Blood uric acid; Xanthine oxidase
高尿酸血症是导致痛风的主要原因，主要的发病机制是血尿酸（uric acid，UA）生成增加或排泄减少[1-2]。治疗高尿酸血症的药物主要有抑制尿酸生成药物（别嘌呤醇等）、促进尿酸溶解药物（拉布立酶等）、降低尿酸药物（氯沙坦等）、促进尿酸排泄药物（苯溴马隆等）[3-4]。目前，一线常用降尿酸药物如别嘌呤醇和丙磺舒，长期使用容易引起肝肾损害[5]、超敏反应、迟发性过敏反应以及严重的皮疹等[6]。因此，寻找更安全有效的降尿酸药物成为研究者的关注点之一。中药治疗高尿酸血症的研究逐步受到关注[7]。汉防己甲素具有多种药理作用[8-9]，研究发现汉防己甲素能够降低SD大鼠血液中尿酸[10]。考虑到汉防己甲素具有消肿、镇痛、抗关节炎等作用，可能是一种潜在的降尿酸药物。因此，本研究通过建立大鼠高尿酸血症模型来探讨汉防己甲素的降尿酸作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
实验动物清洁级SD雄性大鼠，体重（200±20）g，由温州医科大学实验动物中心提供[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2021-0020；
动物伦理号：wydw2022-0080]。40只实验大鼠适应性饲养7d，实验室温度为（25±2）℃，湿度为（55±5）%，每天12h光照交替。采用随机数字表法分为空白对照组、高尿酸血症模型组、别嘌醇模型对照组、汉防己甲素高剂量模型组和汉防己甲素低剂量模型组，每组8只。4个模型组每天上午用腺嘌呤（200mg/kg）与氧嗪酸钾（250mg/kg）溶于聚乙二醇后的溶液灌胃并联合酵母饲料（10g/kg）饲喂1周来构建高尿酸血症大鼠模型，空白对照组喂普通饲料并每天上午灌胃等量聚乙二醇。第8天开始，4组酵母饲料灌胃组每天上午继续灌胃腺嘌呤与氧嗪酸钾，下午给予别嘌呤模型组灌胃40mg/kg的别嘌呤醇（溶于生理盐水），汉防己甲素低剂量和高剂量模型组分别灌胃16mg/kg和32mg/kg汉防己甲素（溶于生理盐水）；
空白对照组与高尿酸血症模型组灌胃同等体积的生理盐水。连续给药21d，每周测量1次体质量并进行尾静脉取血，全血离心取血清存于–80℃冰箱待检。最后1周将大鼠处死，取肝脏，于液氮速冻后存于–80℃待测。
1.2 仪器与试剂
主要试剂：汉防己甲素（货号：F-001-20g）和别嘌醇（货号：A7690）分别购于成都瑞芬思生物科技有限公司和北京索莱宝科技有限公司，腺嘌呤（货号：A6279-100g）和氧嗪酸钾（货号：P137112-100g）分别购于上海麦克林生化科技有限公司和上海阿拉丁生化科技股份有限公司，20%含量的酵母饲料购买于江苏美迪森生物医药有限公司。
主要仪器和耗材：大鼠灌胃针、高速离心机（型号5804R）、冰箱、电子天平及全自动生化分析仪（型号AU5831）。南京建成生物工程研究所的检测腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）试剂盒（A048-2-1，96T），Solarbio的黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性检测试剂盒（货号：BC1095）。
1.3 方法
1.3.1 血液指标监测 造模后每周大鼠尾静脉取血（取血前12h禁食但不禁水），3500转/min，离心10min，分离血清，采用全自动生化分析仪检测血中UA、血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。
1.3.2 脏器酶活性检测 取0.10～0.15g肝脏，按照组织质量（g）∶试剂体积（ml）=1∶10进行混合，用玻璃匀浆器进行冰浴匀浆，在4℃条件下，8500转/min，离心10min，取上清液置于冰上待测。
1.3.3 黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性檢测 按照XOD活性检测试剂盒测定步骤操作，将离心后的上清液样本和检测试剂混匀，37℃水浴/恒温培养箱放置20min，于96孔板中，测定530nm处吸光度，并按样本蛋白浓度计算酶活。XOD活性（U/mg prot）=（?A样本÷?A标准×C标）×1000×V样÷（Cpr×V样）÷T×F=12.5×?A样本÷?A标准÷Cpr×F。其中，单位（U/mg prot）的定义为每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol NO2-定义为一个酶活力单位。另外，?A样本=A测定－A空白，?A标准=A标准－A空白，C标为标准溶液亚硝酸钠的浓度（10μmol/ml），T为反应时间（20min），Cpr为样本蛋白浓度（mg/ml），F为稀释倍数。
1.3.4 腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）活性检测 然后按照ADA试剂盒测定步骤操作，将离心后的上清液样本和检测试剂混匀，37℃水浴/恒温培养箱放置7min，于96孔板中546nm处连续2min吸光度值的变化，计算?A/min，并按样本蛋白浓度计算酶活：组织ADA活性（U/g prot）=（?A测定–?A空白）÷（?A标准-?A空白）×C标÷Cpr。其中，C标为标准溶液腺苷脱氨酶的浓度（38.6U/L），Cpr为样本蛋白浓度（g/L）。
1.4 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（
）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 造模后体质量变化情况
在实验过程中，各组均出现大鼠死亡的现象，对照组1例，各模型组均2例。剔除所有死亡大鼠的数据指标，各组取6只大鼠进行后续统计分析。造模后，除对照组外，各模型组大鼠的体质量都有不同程度的减轻，见图1。
2.2 UA水平比较
干预1周时，除空白对照组外，各组UA水平均显著升高（P<0.05），造模成功。与高尿酸血症模型组相比，干预2周时，别嘌呤醇模型组的UA水平降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；
干预3周、4周时，别嘌呤醇模型组的UA水平显著降低（P<0.05）；
干预2周、3周、4周时，低剂量汉防己甲素组的UA水平与高尿酸血症模型组相比，差异均无统计学意义（P>0.05），干预4周时，高剂量汉防己甲素模型组的UA水平显著降低（P<0.05），见表1。
2.3 Scr和BUN水平比较
各组大鼠初始（第0周）各组Scr和BUN水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。干预1周时，与空白对照组相比，各组Scr和BUN水平均显著升高（P<0.05）。与高尿酸血症组相比，干预2周、3周、4周时，别嘌呤醇模型组的Scr水平均显著降低（P<0.05）；
干预3周、4周时，高剂量汉防己甲素模型组Scr水平均显著降低（P<0.05）；
干预2周时，高剂量汉防己甲素模型组的BUN水平显著降低（P<0.05）。干预2周、3周、4周时，低剂量汉防己甲素组的Scr和BUN水平与高尿酸血症模型组相比，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2、3。
2.4 XOD、ADA活性比较
高尿酸血症模型组大鼠的XOD、ADA活性均显著高于空白对照组（P<0.05）。与高尿酸血症模型组相比，别嘌呤醇模型组大鼠的XOD、ADA活性均显著降低（P<0.05），高剂量汉防己甲素组XOD活性显著降低（P<0.05），高剂量汉防己甲素组ADA活性低于高尿酸血症模型组，差异无统计学意义（P>0.05）；
低剂量汉防己甲素组大鼠XOD、ADA活性与高尿酸血症模型组相比，差异均无统计学意义（P>0.05），见图2、3。
3 讨论
高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱导致尿酸含量升高从而引发的疾病。UA水平偏高与多种疾病有关，已成为威胁患者健康的重要影响因素之一。UA的生成和排泄这两个复杂的代谢过程与其发病有关，而发病的机制可能与嘌呤代谢特异性酶活性的异常或缺失有关[11-12]。中医药具有安全性高、疗效好等优点，目前已经成为高尿酸血症的治疗研究热点之一[13]。
本研究中的高尿酸血症大鼠造模方法主要参考石慧等[14]的文献，采用酵母膏（10mg/kg）饲料喂养，结合腺嘌呤（100mg/kg）灌胃给药联合氧嗪酸钾（300mg/kg）间隔（第1、3、7天）腹腔注射的方案诱导高尿酸血症大鼠模型。该方案可在短期内安全诱导高尿酸血症大鼠模型，模型效果持续时间较长。为了方便给药，本研究在此基础上，每天上午给予大鼠灌胃含200mg/kg腺嘌呤及300mg/kg氧嗪酸钾的混合溶液，结合酵母膏（10mg/kg）饲料喂养的造模方案来构建本研究所需的高尿酸血症模型大鼠。但200mg/kg腺嘌呤及300mg/kg氧嗪酸钾在生理盐水中溶解性差，静置易沉淀，聚乙二醇可以亲水又有一定的亲脂性，是很好的溶剂和增溶剂，因此本研究选择腺嘌呤（200mg/kg）与氧嗪酸钾（250mg/kg）溶于聚乙二醇中灌胃并联合酵母饲料（10mg/kg酵母）喂养的方式来构建高尿酸血症大鼠模型。本研究结果显示，造模1周后，除空白对照组外，各组大鼠UA明显升高，说明模型造模成功，且整个实验过程中大鼠死亡例数在可接受范围（2/8）。
另外，本研究结果显示，與高尿酸血症组相比，各模型组大鼠的Scr和BUN水平显著升高，说明该造模方法对大鼠的肾脏造成了一定损害，与石慧等[14]的报道一致。本研究结果显示，XOD及ADA活性检测结果显示，高剂量的汉防己甲素能显著抑制XOD的活性，对ADA活性可能也具有一定的效应，且对Scr也有一定的调节作用，说明其可用于降低尿酸水平。究其原因，可能是汉防己甲素作为天然活性成分，影响嘌呤代谢中XOD的活性，从而抑制尿酸的生成，调控尿酸盐转运蛋白，促进肾脏排泄尿酸，改善高尿酸血症所致的肾损伤[15]。
综上所述，汉防己甲素对大鼠高尿酸血症有一定的治疗作用，具有潜在的药用价值，下一步计划汉防己甲素对肝脏XOD等关键酶活性的具体影响进行深入研究。
[参考文献][1] 缪建春， 杨泰源， 彭炜， 等. 萆薢车前茯苡汤对高尿酸血症大鼠血尿酸及黄嘌呤氧化酶的影响[J]. 中国医院用药评价与分析， 2016， 16（9）： 1166–1168.
[3] 孙珊珊， 曲连悦， 杜荣蓉， 等. 高尿酸血症药物治疗研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学， 2019， 24（5）： 589–594
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