王蓉 林栩 吴昱升 唐志明 王晨 韦美理 黄慕源 张洁 徐璐瑶
【摘要】 目的 探讨高糖（HG）诱导足细胞损伤中miR-155的表达变化及miR-155与足细胞损伤相关蛋白表达的关系。
方法 体外培养人肾小球足細胞（AB8/13），用30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激AB8/13 48 h作为HG组，同时以终浓度为5 mmol/L的D-葡萄糖溶液处理细胞48 h作为正常对照（NC）组。用CCK8法检测细胞增殖活性。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin的mRNA和miR-155的表达。Western blot法检测nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin蛋白的表达。鬼笔环肽染色观察细胞骨架变化。细胞免疫荧光检测蛋白nephrin、synaptopodin。
结果 HG可抑制足细胞增殖，降低细胞存活率（P<0.01）。HG作用的Ab8/13中的miR-155表达水平升高，nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin的mRNA与蛋白表达水平降低（P<0.05）。HG会导致足细胞骨架紊乱。
结论 HG作用的人足细胞中miR-155表达升高，miR-155表达与HG诱导的足细胞损伤有关，可作为足细胞损伤诊断和治疗的靶点。
【关键词】 足细胞损伤；
miR-155；
高糖；
足细胞相关蛋白
中图分类号：R692.6 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.003
Expression of miR-155 in high glucose induced podocyte injury and its correlation with podocyte injury related protein expression
WANG Rong1，2， LIN Xu1，2， WU Yusheng1，2， TANG Zhiming1，2， WANG Chen1，2， WEI Meili1，2， HUANG Muyuan1，2， ZHANG Jie1，2， XU Luyao1，2
（1. Department of Nephrology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;2. Guangxi Key Laboratory of Basic Guarantee for Medical Research of Immune-related Diseases， Baise 533000， Guangxi， China）
【Abstract】 Objective To investigate the changes of expression of miR-155 in podocyte injury induced by high glucose （HG） and its relationship with podocyte injury related protein expression.
Methods Human glomerular podocytes （AB8/13） were cultured in vitro， AB8/13 stimulated with 30 mmol/L D-glucose solution for 48 h were selected as HG group， and cells treated with a final concentration of 5 mmol/L D-glucose solution for 48 h as normal control （NC） group. Cell proliferation activity was detected by CCK8. Real-time quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to detect nephrin， F-actin， synaptopodin， and the mRNA and miR-155 expressions of p-cadherin. Western blot was used to detect the protein expressions of nephrin， F-actin， synaptopodin and p-cadherin. Cytoskeleton changes were observed by phalloidin staining， and cellular immunofluorescence was used to detect protein nephrin and synaptopodin.
Results HG could inhibit podocyte proliferation and decrease cell survival rate （P<0.01）. The expression level of miR-155 in Ab8/13 induced by HG increased， while the mRNA and protein expression levels of nephrin， F-actin， synaptophodin， and p-cadherin decreased （P<0.05）， and HG could cause disorder of foot cytoskeleton.
Conclusion The expression of miR-155 in human podocytes induced by HG elevates， and miR-155 expression is associated with HG induced podocyte injury， which can be served as a target for the diagnosis and treatment of podocyte injury.
【Key words】 podocyte injury;miR-155;high glucose;podocyte-associated protein
足细胞（podocyte）是肾小球的终末分化细胞，是肾小球过滤屏障形成和维持的重要组成部分，发挥通过分子电荷和大小进行选择性过滤的功能［1］。足细胞损伤（podocyte injury）是导致蛋白尿从而促进包括糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）、狼疮肾炎、局灶节段性肾小球硬化和膜性肾病等肾小球疾病进展的重要始发环节［2］。避免和及时修复足细胞损伤对减少DKD等疾病的发生发展有重要意义。microRNA （miRNA） 是短（20～24 nt）非编码 RNA，通过影响 mRNA 的稳定性和翻译，参与多细胞生物中基因表达的转录后调控［3］。miRNA在肾小球疾病的发生发展中发挥重要作用［4-5］。miR-155 （microRNA 155）是一种 RNA 基因，属于 miRNA 类。miR-155能够通过调节足细胞骨架蛋白的表达减弱DKD引起的肾损害［6-8］，miR-155与足细胞凋亡密切相关［5，9］，提示miR-155在足细胞损伤中起关键作用。本研究通过高糖溶液刺激人肾脏足细胞构建细胞损伤模型，从而研究高糖对足细胞损伤的影响及miR-155与高糖诱导足细胞损伤相关蛋白是否相关。
1 材料与方法
1.1 材料
人肾小球足细胞株AB8/13获赠于英国Bristol大学Moin A.Saleem教授；
胎牛血清（Lonsera）；
RPMI 1640培养基（Gibco）；
胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）；
CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所）；
4%多聚甲醛（absin）；
TrixonX-100（absin）；
CoraLite？倕
488标记鬼笔环肽（proteintech）；
抗荧光衰减封片剂（含DAPI）（Solarbio）；
ＲIPA 蛋白裂解液（Solarbio）；
5x蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂）（Solarbio）;（SDS-PAGE电泳液（碧云天）；
western转膜液（碧云天）；
三色预染蛋白Marker（Affinity）；
双敏化学发光试剂（ECL Reagent）（Affinity）；
Anti-nephrin antibody、Anti-F-actin antibody（abcam）；
GAPDH Ab（Affinity）；
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（proteintech）；
逆转录试剂盒、SYBR Green Qpcr Mix（Monad）；
nephrin、p-cadherin、synaptopodin、GAPDH、F-actin、U6 PCR引物合成（武汉金开瑞生物工程有限公司），miR-155 PCR引物合成（上海生工生物工程股份有限公司），引物序列见表1。多功能酶标仪（Thermo）；
电泳仪（Bio-Rad）；
凝胶成像系统（Tanon）；
激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯公司）。
1.2 方法
1.2.1 足细胞的培养及分组处理
体外培养AB8/13足细胞，足细胞复苏后用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基在37 ℃、5%CO2培养箱条件下培养，每隔2～3 d 换液或传代一次，取对数生长期细胞在不含血清的培养基条件下饥饿培养12 h后用终浓度为30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激培養细胞48 h作为高糖（HG）组，同时以终浓度为5 mmol/L的D-葡萄糖溶液处理细胞作为正常对照（NC） 组［10］。
1.2.2 CCK8法检测细胞增殖
设置As：实验孔（含有细胞、30 mmol/L 的D-葡萄糖溶液、CCK8溶液），Ac：对照孔（含细胞、5 mmol/L 的D-葡萄糖溶液、CCK8溶液），Ab：空白孔（含5 mmol/L 的D-葡萄糖溶液，不含细胞和CCK8溶液）。将各组细胞按5×103个/孔接种于96孔板，每孔的最终体积为100 μL，每组设5个复孔，培养24 h，待细胞贴壁后，更换为无血清培养基饥饿培养12 h，向培养板内各组加入相应的培养液，在培养箱中培养48 h后，在As、Ac组中的每孔内加入10 μL的CCK8溶液，将培养板放培养箱内培养3 h，用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（OD）。细胞存活率=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%。
1.2.3 qRT-PCR检测nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin的mRNA及miR-155表达水平
用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，用超微量紫外分光光度计测定OD260/280及RNA浓度。使用Monad逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。按照Monad荧光定量PCR试剂盒使用说明配置反应体系，使用LightCycler？倕
96 实时荧光定量PCR仪进行检测。检测nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin、GAPDH、miR-155、U6的mRNA表达。每个样品重复实验3次，PCR的反应程序：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，扩增45个循环，72 ℃延伸10 min。相对表达量采用2-△△Ct法来进行数据分析。
1.2.4 Western blot检测nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白表达
加入适量的RIPA裂解液充分裂解各组细胞，4 ℃，12 000 g离心10 min，收集蛋白上清液，BCA 试剂盒测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，100 ℃煮10 min变性。吸取30～50 μg蛋白经电泳分离后转膜至0.45 μm PVDF膜，用含5% BSA的TBST 摇床封闭1 h，1xTBST清洗3次，每次5 min，分别加入一抗稀释液稀释的nephrin（1∶1000）、F-actin（1∶1000）、p-cadherin（1∶1000）、synaptopodin（1∶1000）、GAPDH（1∶10 000）抗体，4 ℃摇床摇晃孵育过夜，第2天TBST洗膜3次，每次3 min后加入相应的抗兔IgG-HRP（1∶5000），室温摇床孵育1 h，TBST 洗膜3次后加入现配置的ECL 发光液，凝胶化学发光成像仪曝光，利用Image J 软件进行蛋白条带分析，以目的条带和GAPDH 条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品重复实验3次。
1.2.5 鬼笔环肽染色观察细胞骨架变化
将各组细胞按2×103的密度接种于共聚焦培养皿内，每个皿内的最终体积为500 μL，移入培养箱内培养，6 h后待细胞贴壁后，每个皿内加入完全培养基至2 mL继续培养、处理，按实验分组干预足细胞，至干预时间点后，吸弃旧培养液，用PBS清洗细胞3次，加入4%多聚甲醛溶液冰上固定细胞15 min，用PBS清洗细胞3次，用含0.2%Triton X-100的PBS溶液室温透化细胞5 min，用PBS清洗细胞3次，分别加入200 μL 荧光标记的鬼笔环肽储液（稀释比例为1∶100），室温避光孵育20 min进行染色，用PBS清洗细胞3次，每个皿内分别滴加50 μL的抗荧光衰减封片剂（含DAPI），激光共聚焦显微镜下观察。
1.2.6 细胞免疫荧光检测
按实验分组干预足细胞，干预到时间点后，用PBS清洗3次，每次5 min，用4%多聚甲醛溶液冰上固定15 min，用PBS清洗3次，再加入PBS 溶液稀释的0.2% Triton X-100，室温孵育5 min 后，PBS清洗3次，向各孔中加入适量的5%正常山羊血清，常温孵育1 h，吸水纸吸掉封闭山羊血清，PBST清洗3次，加入抗体稀释液稀释的nephrin（1∶500）、F-actin（1∶500），4 ℃孵育过夜，次日将一抗弃掉，PBST清洗3次，滴加稀释好的荧光二抗（1∶500），室温避光孵育1 h，PBST清洗3次，往各孔中滴加抗荧光衰减封片剂（含DAPI），在激光共聚焦显微镜下观察采集图像。
1.3 统计学方法
运用SPSS 26.0统计软件分析数据。所有数据均进行正态分布和方差齐性检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。
2 结 果
2.1 观察细胞的形态学特征
在37 ℃，5%CO2条件下培养细胞，使用相差显微镜观察细胞，发现细胞周边有足突，细胞与细胞之间有足突间隙连接，一些细胞呈“树枝状”。见图1。
2.2 nephrin、synaptopodin在实验细胞中的表达
免疫荧光法检测肾小球足细胞的特异性蛋白nephrin、synaptopodin，实验结果表明，实验过程中用的细胞荧光染色明显，表达nephrin、synaptopodin蛋白。见图2。nephrin蛋白是足细胞特异性蛋白，主要表达在细胞的胞膜、细胞质和核周。synaptopodin蛋白是反映足细胞分化成熟的特异性蛋白。所以，实验用的细胞的形态学特征符合人肾小球足细胞，且表达足细胞特异性nephrin、synaptopodin蛋白，因此，本实验用的细胞是人肾小球足细胞，可用于后续的试验。
2.3 HG干预对体外培养的人肾小球足细胞增殖活性的影响
30 mmol/L的D-葡萄糖溶液作用于足细胞，干预时间为48 h，与正常对照组相比较，细胞增殖活性受到抑制，细胞活性降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见图3。
2.4 HG诱导足细胞损伤对miR-155表达的影响
正常对照组中miR-155的表达量较低，使用30 mmol/L的D-葡萄糖溶液作用于足细胞48 h，miR-155表达上调，差异有统计学意义（P<0.01） 。见表2。
2.5 HG诱导足细胞损伤对nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin mRNA 表达的影响
与正常对照组相比，HG干预足细胞48 h后，nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin 的mRNA表達均明显下调。见表2。
2.6 HG诱导足细胞损伤对nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白的影响
Western blot 结果显示，HG干预足细胞48 h后，HG组nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白与NC组相比较均明显降低（P<0.05）。见图4。
2.7 高糖诱导足细胞损伤细胞骨架变化
激光共聚焦显微镜观察足细胞骨架显示：NC组足细胞骨架排列有序，结构清晰，沿细胞长轴呈放射状分布，足突明显，荧光强度明亮，而HG组足细胞形态发生改变，变圆钝、皱缩，骨架结构断裂，排列紊乱，足突减少，与NC组相比较，荧光强度表达明显暗淡。见图5。
2.8 细胞免疫荧光检测nephrin、synaptopodin蛋白
结果显示，足细胞nephrin蛋白主要在胞膜、细胞质及核周表达，呈颗粒或线状分布，HG组nephrin蛋白荧光与NC组相比较，表达量减少，nephrin蛋白荧光减弱，蛋白表达趋势与Western blot、qRT-PCR结果一致。synaptopodin只在分化成熟的足细胞中表达，主要分布在胞浆、周边、次级突起，HG处理后的足细胞synaptopodin蛋白荧光减弱，部分向核周分布。synaptopodin蛋白的表达与Western blot、qRT-PCR结果一致。见图6。
3 讨 论
DKD被认为是糖尿病的主要微血管并发症，是导致终末期肾病的主要原因［11］。尽管近年来关于DKD的研究已取得很大进展，但其分子水平的具体发病机制尚未明确。足细胞是终末分化的肾小球内脏上皮细胞，是肾小球滤过屏障的重要组成部分。肾小球足细胞损伤是肾小球功能障碍的核心事件，可导致糖尿病介导的蛋白尿和肾脏疾病［12］。在临床实践中发现糖尿病患者早期会有足细胞丢失和足细胞完整性受损［13］。足细胞在DKD中经历了一系列形态和功能变化，包括肥大、上皮-间质转化、分化、脱落和凋亡［14］。足细胞损伤伴随着细胞活力、炎症、纤维化的降低和足细胞功能障碍的增加［15］，高血糖会诱导培养的足细胞凋亡并减少足细胞数量，加速足突消失和尿白蛋白排泄［16］。另外，高血糖和血管紧张素Ⅱ引起的足细胞损伤，如氧化应激、足细胞死亡和线粒体功能障碍，已被证实与 DKD 中的 GFB 破坏和蛋白尿密切相关［17］。因此，肾小球足细胞损伤被认为是导致DKD的主要机制之一。然而，控制足细胞损伤的相关机制尚不清楚。因此，足细胞損伤相关机制的研究可为DKD发病机制的研究提供思路。
miRNA在人类细胞和组织中广泛表达，参与了细胞增殖凋亡、人体病理生理以及疾病发展预后等过程。miR-155在多个层面参与生物控制，通过靶mRNA 的翻译抑制或不稳定来调节对细胞发育和功能至关重要的基因表达［2］。已发现 miR-155 在几种活化的免疫细胞中明显上调，包括 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC）。在先天免疫反应过程中，它被广泛的炎症介质上调［5］。据报道，miR-155在某些细胞和动物模型中抑制葡萄糖代谢［18］，由 miR-155调节影响葡萄糖和脂质代谢的靶基因仍然未知。因此，深入研究miR-155调控糖尿病肾病的分子机制有利于进一步阐明DKD足细胞损伤的发病机制。
nephrin 是一种重要的裂隙隔膜蛋白［19-20］，可协调足细胞中细胞连接和细胞骨架动力学之间的相互作用。其他裂孔隔膜蛋白p-cadherin和synaptopodin对稳定足细胞的正常生理功能具有重要作用［20］。足细胞有着复杂的肌动蛋白细胞骨架结构，肌动蛋白F-actin严格控制足突的形成过程［21］，因此，细胞骨架结构的稳定性与足细胞的损伤密切相关。本研究证实高糖诱导足细胞损伤模型中，足细胞的增殖活性受到抑制，足细胞相关蛋白因子nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin的mRNA和蛋白表达减少，细胞骨架结构回缩、断裂，排列紊乱，最终导致足细胞足突融合、消失等。
本研究证实，在高糖诱导的足细胞损伤模型中，miR-155表达上调，表明miR-155参与高糖诱导的足细胞损伤过程，为DKD的防治提供了新的思路，但 miR-155 在高血糖诱发的肾病中的作用仍不清楚，其具体作用机制仍需进一步开展深入研究。
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（收稿日期：2022-08-12 修回日期：2022-10-08）
（编辑：梁明佩）
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