沈剑 廖海英 黄谦
[摘要]目的：基于生物信息學构建GOPC（golgi associated PDZ and coiled-coil motif containing）的皮肤黑素瘤（Skin cutaneous melanoma，SKCM）预后模型，进一步为SKCM的早期筛查发挥一定的指导意义。方法：提取癌症基因组图谱TCGA数据库中的SKCM数据和GTEx数据库对应的正常组织数据。利用ggplot2包绘制GOPC在两者之间的表达差异。采用基因本体（GO）数据库和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库对GOPC基因进行进一步功能富集分析，探索该基因潜在的功能和通路。采用单因素/多因素Cox回归分析筛选与SKCM相关的影响因素，再通过rms包构建列线图建立SKCM患者预后模型，ROC曲线评价构建的模型预测SKCM患者预后的价值，最后通过survival包构建关于总生存期（Overall survival，OS）的生存曲线。结果：在1282例样本中正常组织样本有813例、皮肤黑素瘤组织样本有469例，发现GOPC在这两组之间有表达差异（P＜0.001）。该模型预测SKCM患者总生存的ROC曲线下面积（AUC）为0.776，说明其具有一定的诊断价值。K-M曲线中GOPC高表达预后较差（P=0.036）。在多因素COX回归中GOPC在SKCM中也是独立预后风险因素（HR=0.506，95%CI=0.263～0.971，P=0.041），表明模型对SKCM患者生存具有较高的预测能力。结论：构建的SKCM的GOPC基因预后模型可用于预测SKCM患者的预后，为黑素瘤的精准化治疗提供了新的思路。
[关键词]生物信息学；
黑素瘤；
预后模型；
GOPC；
生物标志物
[中图分类号]R739.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2023）03-0070-05
Abstract：
Objective To construct a golgi associated PDZ and coiled-coil motif containing （GOPC） prognostic model of cutaneous melanoma （skin cutaneous melanoma，SKCM） based on bioinformatics to further play a guiding role in early screening of SKCM. Methods the SKCM data of cancer genome map TCGA database and the corresponding normal tissue data of GTEx database were extracted. Ggplot2 package was used to draw the expression difference of GOPC between them. Gene Ontology （GO） database and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome （KEGG） database were used to further analyze the functional enrichment of GOPC gene to explore its potential function and pathway. Univariate/multivariate Cox regression analysis was used to screen the influencing factors related to SKCM， and then the prognosis model of SKCM patients was established by rms package. The prognostic value of the model constructed by ROC curve was evaluated. Finally， the survival curve of OverallSurvival was constructed by survival package. Results among the 1282 samples， there were 813 normal tissues and 469 skin melanoma tissues. It was found that there was a difference in the expression of GOPC between the two groups （P＜0.001）. The area under the ROC curve （AUC） of the model for predicting the total survival of patients with SKCM is 0.776， indicating that it has a certain diagnostic value. The high expression of GOPC in K-M curve showed a poor prognosis （P＜0.05）. In multivariate COX regression， GOPC was also an independent prognostic risk factor in SKCM （HR=0.506，95% CI=0.263-0.971）， indicating that the model has a high ability to predict the survival of patients with SKCM. Conclusion the GOPC gene prognostic model of SKCM can be used to predict the prognosis of patients with SKCM， which provides a new idea for accurate treatment of melanoma.
Key words：
bioinformatics; skin cutaneous melanoma;prognostic model; GOPC; biomarkers
皮肤癌是全世界最常见的癌症之一，而SKCM是仅次于基底细胞癌和鳞状细胞癌中第三常见的皮肤癌[1]。SKCM的发生与黑素细胞痣、紫外线照射、种族和遗传、外伤、内分泌及病毒等因素密切相关。一般情况下，早期SKCM可通过手术治愈，但是一旦转移，可导致患者在短期内死亡[2]。随着科学的发展，针对SKCM的治疗方法包括免疫治疗、基因治疗及靶向治疗等，但这些方法只对少数患者有效，而导致这一结果最主要的原因是对SKCM的发病机制和诊断标志物认识不足，所以有必要探索新的SKCM标志物来指导临床治疗。因此，笔者建立GOPC预后模型，发现其具有一定的诊断价值。笔者旨在确定皮肤黑素瘤的发病机制和预后生物标志物，将其用作皮肤黑素瘤新的治疗靶点。
1 资料和方法
1.1 数据的收集与处理：通过从UCSC数据库（https：xenabrowser.net/datapages）中提取TCGA和GTEx的TPM（Transcripts per million reads）格式的RNAseq数据，进一步验证了GOPC在泛癌中的正常样本与肿瘤样本的差异表达值，发现其在黑素瘤与正常样本这两组中有表达差异。然后提取SKCM数据，将1282个样本分为肿瘤组（469个肿瘤样本）和对照组（813个正常样本）。将TPM格式的RNAseq数据进行log2转化后进行样本间的表达比较， 再使用R统计软件包中的ggplot2工具对两组表达差异基因进行分析。
1.2 基因功能富集分析：通过TCGA数据库下载SKCM数据进行|r|＞0.2且P＜0.05筛选后，再通过R语言软件org.Hs.eg.db包、clusterProfiler包及ggplot2包对GO数据库及KEGG数据库进行分析，P＜0.05表明差异具有统计学意义。通过clusterPorfiler包对GOPC高低表达组进行GSEA分析，根据数据富集情况，找出GOPC表达可能富集的相关信号通路。
1.3 GOPC预后模型的构建：通过TCGA数据库下载黑素瘤的数据，应用R语言软件survival包进行单因素/多因素Cox回归分析，使用rms包、survival包进行Nomogram绘制，P＜0.05表明差异具有统计学意义。通过中位数将GOPC分为高GOPC组、低GOPC组，分别应用survival包、survminer包进行Kaplan-Meier总生存曲线，最后通过pROC包、ggplot2包进行ROC曲线绘制。
1.4 统计学分析：统计分析和图形绘制采用R语言软件（3.6.3版）。正态分布计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，非正态分布计量资料以中位数（范围）表示；
K-M生存曲线以log-rank检验表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 GOPC基因在SKCM中表达下调：通过TCGA数据库及GTEx数据库中的数据（1282例样本其中正常组织样本有813例、皮肤黑素瘤组织样本有469例），发现GOPC在SKCM中表达下调（P＜0.001）。见图1。
2.2 GOPC高低表达组共表达差异基因热图：通过TCGA的SKCM数据，以GOPC表达情况根据表达中位数为中间值将其分为两组分别是高表达组、低表达组，用于分析GOPC与共表达差异基因的相关性。结果显示与GOPC基因高表达top10相关基因主要有NUS1、BCLAF1、UFL1、ATG5、PPIL4、LATS1、CDC40、ZUP1、MAP3K7、IBTK；
与GOPC基因低表达top10相关基因主要有MRPL41、AC136632.2、MT-ND3、OCA2、TECRP1、AGPAT2、DPP7、TECR、NUDT8、ATOX1并绘制热图。见图2。
2.3 基因功能富集分析：对GOPC的共表达差异基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，找出共表達基因富集的信号通路。GO富集分析并对其主要的富集通路绘制了气泡图。见图3。
结果显示：分子功能富集主要包括泛素样蛋白转移酶活性、作用于RNA的催化活性、解旋酶活性；
在细胞成分富集主要包括核颗粒、染色体区域、泛素连接酶复合体、染色体着丝粒区域；
在生物学过程富集主要包括蛋白酶体蛋白分解代谢过程、RNA剪切、蛋白酶体介导的泛素依赖蛋白分解代谢过程、RNA定位。KEGG通路分析结果显示，这些GOPC的共表达差异基因主要富集的通路有细胞周期、基本转录因子、RNA转录、泛素介导的蛋白质降解等。见图4。
2.4 临床相关性分析
2.4.1 GOPC临床相关的基线资料表：进一步研究了SKCM的临床变量与GOPC高低表达差异之间的关系（见表1）。本研究利用卡方检验或Fisher分析发现GOPC的差异表达与各因素之间无明显表达差异。
2.4.2 GOPC预后模型评估（ROC曲线分析）：为了研究GOPC对SKCM的诊断是否存在作用。通过ROC（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲线分析GOPC对SKCM的诊断效能（见图5）。显示：GOPC的曲线下面积（AUC）为0.776（0.750-0.802），这提示了GOPC可能为潜在的诊断分子。
2.5 预后模型的构建
2.5.1 KMplot曲线分析：下载TCGA-SKCM患者预后信息，利用survminer、survival包绘制Kaplan-Meier图，评估GOPC在SKCM中总生存期的预后价值（见图6）。按照表达量中位数从而分成高表达组、低表达组。结果显示低表达GOPC具有更差的总生存期[HR=0.75（0.57-0.98），P=0.036]。
2.5.2 单因素/多因素Cox回归分析：将单因素Cox回归P＜0.05的变量纳入到多因素Cox回归中.通过多因素Cox回归分析发现：M分期（P=0.001）、GOPC（P=0.041）在皮肤黑素瘤OS中是独立预后因子（P＜0.05）。见表2。
2.5.3 列线图预测模型：利用风险模型结合放疗、GOPC、肿瘤T分期、肿瘤N分期、肿瘤M分期、放疗等构建列线图（见图7），成功构建可量化的预后模型。列线图一致性（Concordance，C-index）：0.661（0.638-0.683）。
3 讨论
黑素瘤作为致命的皮肤癌[3]具有较高的转移率和死亡率[4-5]，研究发现一旦出现转移，患者的中位生存时间仅为8～9个月，而5年生存率低于5%，这种疾病严重威胁人们的健康[6]，因此它被认为是皮肤癌最常见的死亡原因。最近的分子生物学研究发现，在30%～60%的黑素瘤中及50%的交界痣中可发现BRAF基因突变[7]，而与国外的报道相比，我国黑素瘤BRAF基因突变率相对低，约为24.3%[8]。联合使用BRAF和MEK抑制剂是晚期BRAF突变黑素瘤患者的治疗标准之一。目前有针对性的靶向治疗（如BRAF和MEK抑制剂）和免疫治疗（如单独抗pd-1抗体或与抗ctla4抗体联合使用），这已使晚期黑素瘤的全身治疗发生了巨大变革，但是大多数反应都是暂时的，几乎所有患者都在1年内出现肿瘤复发[9]。目前急需一种既容易获取又能靶向治疗的药物。
GOPC基因在各个组织中广泛表达，它具有多种重要的生物学功能，比如可参与分泌和内吞途径的膜泡转运过程，并且可以与syntaxin6、golgin160、wnt家族蛋白（frizzled5 和frizzled8）、δ2型谷氨酸受体（GluRδ2）以及与β1型肾上腺素受体（β1AR）等蛋白质相互作用，大部分相互作用都是与PDZ结构域直接相关的[10]。Kasey L研究中发现皮肤黑素瘤中具有GOPC-ROS1基因融合[11]，而笔者研究中发现GOPC在皮肤黑素瘤中表达下调，GOPC的表达水平与患者的总生存率相关， GOPC的表达水平越高，皮肤黑素瘤患者的预后越好。GOPC的曲线下面积（AUC）为0.776（0.750-0.802），且多因素Cox回归分析发现：GOPC（P=0.041）在皮肤黑素瘤癌OS中是独立预后因子（P＜0.05）。并且有可能是通过细胞周期、基本转录因子、RNA转录、泛素介导的蛋白质降解等通路来调节皮肤黑素瘤的发生、发展。
当然，本研究也存在一些不足之处。首先，由于缺乏体外或体内实验，所以需要进行相关的实验如细胞生物学分析、动物和临床研究，用于验证从笔者的生物信息学分析中确定的GOPC基因表达和信号通路。其次，需要更多的临床信息用于筛选可能与SKCM总体生存率、无病生存率相关的临床因素如吸烟史、主要肿瘤大小、肿瘤部位是否暴露或未暴露于阳光的区域、家族史等因素以提高数据可靠性。
在皮肤黑素瘤中，GOPC表达水平较正常组织中明显降低。功能富集分析发现GOPC蛋白可参与泛素样蛋白转移酶活性、RNA的催化活性、解旋酶活性核颗粒、染色体区域、泛素连接酶复合体、染色体着丝粒区域、蛋白酶体蛋白分解代谢过程、RNA剪切、蛋白酶体介导的泛素依赖蛋白分解代谢过程、RNA定位。KEGG通路分析结果显示，这些GOPC的共表达差异基因主要富集的通路有细胞周期、基本转录因子、RNA转录、泛素介导的蛋白质降解。生存分析发现GOPC可以预测皮肤黑素瘤患者的预后，并且其高表达水平预测患者较好的总生存率。多因素Cox分析中发现GOPC的表达水平可以作为皮肤黑素瘤患者的独立预后因子。因此，GOPC可能通过多种途径调控皮肤黑素瘤细胞的发生和发展，是其潜在的生物学预后标志物及治疗靶标，具有深入研究的临床价值。
[参考文献]
[1]Linos E，Swetter S M，Cockburn M G，et al.Increasing burden of melanoma in the United States[J].J Invest Dermatol，2009，129（7）：1666-1674.
[2]Lugovic-Mihic L， Cesic D， Vukovic P， et al. Melanoma development：current knowledge on melanoma pathogenesis[J]. Acta Dermatovenerol Croat， 2019， 27（3）：163-168.
[3]Chu H，Li M，Wang X.Capsaicin induces apoptosis and autophagy in human melanoma cells[J].Oncol Lett，2019，17（6）：4827-4834.
[4]Rastrelli M，Tropea S，Rossi C R，et al. Melanoma：epidemiology，risk factors，pathogenesis，diagnosis and classification[J].In Vivo，2014，28（6）：1005-1011.
[5]Wei D A. Multigene support vector machine predictor for metastasis of cutaneous melanoma[J].Mol Med Rep，2018，17（2）：2907-2914.
[6]地里夏提·庫尔班，陈召.Notch1调控PI3K/AKT信号通路促进黑素瘤细胞发展的研究[J].中国美容医学，2019，28（01）：93-96
[7]Moran B，Silva R，Perry A S，et al.Epigenetics of malignant melanoma[J].Semin Cancer Biol，2018，51（1）：80-88.
[8]Wu X，Yan J，Dai J，et al.Mutations in BRAF codons 594 and 596 predict good prognosis in melanoma[J].Oncol Lett，2017，14（3）：3601-3605.
[9]Rossi A，Roberto M，Panebianco M，et al. Drug resistance of BRAF-mutant melanoma：review of up-to-date mechanisms of action and promising targeted agents [J].Eur J Pharmacol，2019，27（3）：163-168.
[10]李祥，张家海，曹赞霞，等.GOPC蛋白PDZ结构域的溶液结构及其与Neuroligin羧基末端的相互作用[C].第十次中国生物物理学术大会论文摘要集，2006：284.
[11]Ha J H，Lee C，Lee K S，et al.The molecular pathogenesis of Trichilemmal carcinoma[J].BMC Cancer，2020，20（1）：516.
[收稿日期]2022-07-22
本文引用格式：沈剑，廖海英，黄谦.基于生物信息学构建GOPC的皮肤黑素瘤预后模型[J].中国美容医学，2023，32（3）：70-74.
猜你喜欢生物标志物黑素瘤生物信息学儿童黑素瘤诊断进展实用皮肤病学杂志(2020年1期)2020-04-20基于UPLC—Q—TOF—MS技术的牛血清白蛋白诱导过敏反应的代谢组学研究中国中药杂志(2016年21期)2017-02-16基于UPLC—Q—TOF—MS技术的牛血清白蛋白诱导过敏反应的代谢组学研究中国中药杂志(2016年21期)2017-02-16“PBL+E—learning”教学模式探索中国教育信息化·基础教育(2016年10期)2016-12-20移动教学在生物信息学课程改革中的应用今传媒(2016年11期)2016-12-19中医大数据下生物信息学的发展及教育模式浅析电脑知识与技术(2016年27期)2016-12-15黑素瘤前哨淋巴结活检与淋巴结观察的最终对照研究报告中华皮肤科杂志(2015年11期)2015-01-23息肉样黑素瘤一例中华皮肤科杂志(2014年3期)2014-12-19