赵宝山，孙光蕊，邢志君，张志民，张 旭，梁宗英
（承德医学院附属医院胸外科，承德 067000）
肺腺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤，且发病年龄的年轻化趋势愈加明显[1]。肺腺癌具有放化疗不敏感、血行转移早的特点，致使患者的总体预后不佳[2-3]。因此，提高肺腺癌的早期诊断率、发现评估预后的新指标和新靶点是肺腺癌治疗的重中之重[4-5]。痉挛性截瘫20（SPG20）是发现于肌肉截瘫中的基因，其编码的蛋白在细胞分裂周期的异常作用与肿瘤的发生具有相关性[6]；
研究[7-9]表明，SPG20甲基化与结直肠癌、肝癌和胃癌之间存在密切关系，并作为早期事件。目前对于SPG20基因在肺腺癌组织内甲基化修饰的研究未见报道。本研究通过检测肺腺癌组织内SPG20甲基化水平，探讨其甲基化与肺腺癌发生和发展的相关性。
1.1 标本来源
选取2018年2月至2019年8月承德医学院附属医院胸外科进行手术治疗的70例原发肺腺癌患者。其中男性27例，女性43例；
≥60岁者38例，<60岁者32例；
吸烟患者22例，不吸烟患者48例；
按照IASLC第八版制定的标准进行TNM分期[3]：Ⅰ期23例，Ⅱ期32例，Ⅲ期15例；
组织学分级：高分化4例，中分化58例，低分化8例；
有淋巴结转移11例，无淋巴结转移59例。实验组：70例肺腺癌组织；
对照组：70例正常肺组织（距癌组织＞6 cm，经术后病理鉴定）。
1.2 主要试剂和仪器
甲基化修饰试剂盒（德国QIAGEN公司）；
焦磷酸测序试剂（CST公司）；
DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司）；
Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（美国Sigma公司）、2×SYBR qPCR Master Mix（美国Promega公司）、PCR扩增仪（美国MJ Research公司）、Real-time PCR仪（MX3000P）（美国Startagene公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 DNA提取 取肺腺癌组织及癌旁组织标本100 mg，按照基因组DNA提取试剂盒说明和步骤分别提取DNA，并采用紫外分光光度计检测提取的DNA含量和纯度。提取后-20℃保存DNA。
1.3.2 亚硫酸氢钠处理 取纯化的DNA样品20μL，以DNA重亚硫酸盐转化试剂盒对组织和血清样本DNA进行亚硫酸盐修饰。将DNA置于95℃水浴中加热20 min，再冰浴20 min，置于42℃、浓度为3 mol·L-1的NaOH溶液中温浴20 min。先加入NaHSO3处理液，50℃恒温16 h。再添加1 mL 37℃的树脂，将混匀后的液体真空抽滤后，以80%异丙醇洗涤，析出DNA，以NaOH、冰乙醇、醋酸铰沉淀后，以80%乙醇洗涤，低温保存备用。
1.3.3 甲基化特异性聚合酶链反应 甲基化引物由华大基因设计并合成。SPG20甲基化引物：F：5’-AGGAAGTATGAAAGAATGTATTGTAAAG-3’；
R：5’-CCCCTCAAAATTAAACAACCTTTCTCTACA-3’。反应体系为50μL，甲基化的反应条件为：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，50℃退火，72℃延伸1 min，40个循环，最后一个循环72℃延伸7 min。
1.3.4 Pyrosequencing的检测 2μL反应结合珠加入到96孔PCR反应板中，结合38μL缓冲液、40μL PCR产物；
充分混匀后于室温放置10 min。PCR产物和结合珠混悬液应用真空泵吸取，依次放入乙醇、NaOH及冲洗缓冲液中均5 s。将探头上结合珠以及PCR产物放入40μL退火缓冲液中，85℃变性2 min，冷却到室温，使模板与引物退火杂交。应用Pyrosequencing软件序列设计信息计算剂量，于试剂舱内依次放入底物混合物，酶混合物，4种dNTP（QIAGEN）。将96孔反应板和试剂舱放进Pyrosequencing检测仪（PyroMark Q96 ID，QIAGEN）中进行反应，Pyro Q-CpG软件将自动分析每一个位点的甲基化状态。以4个CpG位点甲基化改变平均值作为甲基化结果，以正常肺组织作为对照组；
阈值为对照组甲基化发生率平均数+对照组样本标准差×2（18.9）。
1.3.5 qRT-PCR检测SPG20mRNA的相对表达量 将组织总RNA逆转录成cDNA，按照RT-PCR试剂盒说明书操作进行qPCR反应，反应条件：95℃预变性2 min；
95℃变性10 s，60℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2△△CT法计算SPG20mRNA相对表达量。
1.3.6 免疫组化检测SPG20蛋白表达量 将组织蜡块4μm切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇浸泡，滴加3%H2O2，室温放置10 min。破膜后，将切片放入柠檬酸缓冲液，置于微波炉中高温修复抗原12 min。切片自然冷却后，滴加山羊血清，室温放置20 min进行封闭。清洗后，在湿盒中加入一抗（兔抗人SPG20单克隆抗体，1∶1 000）孵育4℃过夜。室温条件下，加入二抗（山羊抗兔）孵育30 min。DBA显色，苏木素复染细胞核。免疫组化结果判断标准：根据细胞膜、细胞质染色程度和着色阳性细胞所占百分比进行评价计分（每张切片高倍镜下随机观察10个视野）；
染色强度评分标准（A）：无色（0分），淡黄色（1分），棕黄色（2分），棕褐色（3分）。着色阳性细胞所占百分比评分标准（B）：1分（阳性细胞≤10%），2分（阳性细胞10%～50%），3分（阳性细胞50%～75%），4分（阳性细胞＞75%）。以A+B所得分数作为评判标准：0～2分为阴性，3～4分为阳性，5～7分为强阳性。
1.3.7 Western blot检测SPG20蛋白表达量 提取蛋白，BCA蛋白浓度测试计算样本蛋白浓度。以蛋白+去离子水120μL中含蛋白900μg，计算并配制蛋白液120μL，制作电泳蛋白上样液。按序号各孔加入电泳蛋白上样液15μL，留适当位置加入预染Marker。连接电泳装置，以80 V电压电泳至蛋白样品适度进入分离胶，电压转为120 V电泳至Marker分条宽度适度。切取目标条带Marker附近适当宽度，按胶大小剪膜，并剪切右上角标记膜正面，以正面贴近胶。以正极→滤纸→PVDF膜→胶→滤纸→负极顺序制作“三明治”。4℃、90 V转膜70 min。将PVDF膜取出并移入TBST洗膜液中。用水平摇床摇晃平皿，摇床设定为80 r·min-1，洗膜5 min。取出膜后置于5%脱脂奶粉TBST溶液中，封闭2 h。用平头镊子将膜取出，置于装有TBST液的平皿中。将水平摇床设定为80 r·min-1，平皿放在水平摇床上洗膜；
每次5～10 min，每次更换TBST液，重复洗膜3次。按比例孵育一抗（按SPG20抗体1∶1 000；
GAPDH抗体1∶1 000），摇匀后，4℃过夜。抗体稀释液为TBST溶解2.5%脱脂奶粉。次日水平摇床用TBST液快速洗膜3次，每次10 min。按1∶2 000比例混匀后，孵育二抗，室温孵育2 h。用平头镊子将膜取出，置于装有TBST液的平皿中。将水平摇床设定为80 r·min-1，平皿放在水平摇床上洗膜；
每次5～10 min，每次更换TBST液，重复洗膜3次。置入暗室显像系统发光显像。通过凝胶成像系统对条带进行扫描，根据灰度值进行定量分析。以总蛋白内GAPDH蛋白条带作为内参对照。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/总蛋白中GAPDH蛋白条带灰度值×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计数资料以百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验；
计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；
甲基化水平与表达量之间的相关性采用Spearman相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。
2.1 肺腺癌和正常肺组织中SPG20甲基化水平比较
焦磷酸测序法检测结果显示：SPG20基因在肺腺癌和正常肺组织中均可发生甲基化。肺腺癌组织中甲基化率高于正常肺组织甲基化率（P＜0.01），见表1。
表1 肺腺癌和正常肺组织中SPG20甲基化水平比较［例（%）］
2.2 肺腺癌和正常肺组织中SPG20 mRNA表达量比较
实时荧光定量PCR结果显示，70例肺腺癌组织中SPG20mRNA相对表达量（1.22±0.47）低于正常肺组织（5.79±1.13）（P＜0.05），见图1。
图1肺腺癌和正常肺组织中SPG20 mRNA表达量比较
2.3 肺腺癌和正常肺组织中SPG20蛋白表达阳性率比较
免疫组化结果显示，SPG20蛋白主要表达于细胞核内，细胞质内少量表达。SPG20在腺癌组织中呈低表达甚至不表达，其阳性率为24.29%（17/70），而正常肺组织中SPG20则呈高表达，其阳性率高达68.57%（48/70）。SPG20在肺腺癌组织中的阳性表达低于正常肺组织（P<0.05），见图2。
图2 肺腺癌和正常肺组织中SPG20蛋白表达（HE×40）
2.4 肺腺癌和正常肺组织中SPG20蛋白表达量比较
Western blot检测结果显示，SPG20在肺腺癌组织中低表达，其蛋白表达量（15.78±1.85）%低于正常肺组织（63.14±2.05）%（P<0.05），见图3。
图3 肺腺癌和正常肺组织中SPG20蛋白表达量比较
2.5 肺腺癌组织中SPG20蛋白表达与甲基化的相关性
相关分析结果显示，在肺腺癌组织中，SPG20蛋白表达水平与SPG20甲基化呈负相关（r＝-0.457，P＜0.01），见表2。
表2 肺腺癌组织中SPG20蛋白表达与甲基化的相关性（例）
2.6 肺腺癌组织中SPG20甲基化和临床病理特征的相关性
SPG20甲基化水平与肺腺癌TNM分期、组织分化程度及淋巴结转移有关（P＜0.05）；
与患者性别和年龄无关（P＞0.05），见表3。
表3 肺腺癌组织中SPG20甲基化和临床病例特征的相关性
肺腺癌是肺癌多种病理类型中最常见的一种，占肺癌发病率的一半以上[10]。目前针对肺腺癌患者的手术、放化疗及基因靶向治疗虽取得了一定的进展，但肺腺癌患者总体预后仍有待进一步提高[11]。肺腺癌的发生是多个基因、多个阶段、多个因素及多种机制参与的共同结果[12]。因此，从基因分子学角度深入分析肺腺癌发生发展机制、发现评估预后的新指标和新靶点、提高肺腺癌的远期存活率是肺腺癌治疗的首要任务。
SPG20基因编码SPG20多功能蛋白，在细胞分裂周期中起到关键作用，且其异常表达与肿瘤的发生密切相关[6]。SPG20在结肠癌、食管癌及弥漫大B淋巴瘤组织中均呈现低表达状态，且其表达与患者的预后密切相关[13-15]。但关于SPG20在肺腺癌中的表达情况未见相关报道。本研究通过实时荧光定量PCR检测肺腺癌中SPG20mRNA表达水平，结果显示，肺腺癌组织中SPG20mRNA表达水平高于正常肺组织，提示肺腺癌中SPG20在基因转录水平上受到了抑制。本研究进一步通过免疫组化和蛋白免疫印迹检测SPG20蛋白表达量，结果显示，肺腺癌组织中SPG20蛋白呈低表达，而正常肺组织中则呈高表达。蛋白免疫印迹检测结果同免疫组化检测结果一致，提示肺腺癌中SPG20可能在基因转录水平上受到了抑制，进而导致翻译和合成的蛋白表达量下降。研究结果显示：肺腺癌组织和正常肺组织中SPG20mRNA和蛋白的差异表达可能与肺腺癌的发生、发展密切相关，但其表达受到抑制的机制不明确。
DNA甲基化是一种不涉及核苷酸序列变化的、可遗传的基因表达方式的共价修饰，是肿瘤发生机制中的表观遗传形式之一，与多种肿瘤的发生和发展密切相关[16-17]。研究[18-20]证实，DNA甲基化修饰的紊乱状态可能使基因表达异常或者导致肿瘤发展、转移、恶化，最终导致患者死亡。DNA甲基化是生物体中调控基因表达的常见方式之一，在肺癌[21]、乳腺癌[22]、胶质瘤[23]、卵巢癌[24]等肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用。SPG20基因发生甲基化会造成基因表达抑制，SPG20蛋白减少或缺失最终导致肿瘤的发生。尹建浩等[7]对结直肠癌患者粪便中SPG20等基因进行了甲基化分析，结果显示，SPG20在结直肠癌患者粪便标本中呈明显的高甲基化状态，而蛋白则呈低表达状态，这对结直肠癌的早期诊断和筛查具有重要意义。Zhou等[8]通过体外实验证实了在胃癌中通过甲基化诱导SPG20沉默可以通过激活EGFR/MAPK通路，促进胃癌细胞的增殖。研究发现，肝癌组织中SPG20蛋白呈低表达，但其甲基化水平高于癌旁组织，且SPG20的表达水平与甲基化水平呈负相关[9]。目前关于SPG20基因在肺腺癌组织内甲基化修饰的研究未见报道，试图用逆转SPG20基因甲基化状态来治疗肺腺癌的研究更是国内外的空白。本研究通过检测肺腺癌组织中SPG20基因甲基化水平，并分析了甲基化程度与蛋白表达及患者临床病例特征的相关性。结果显示，肺腺癌组织中SPG20基因发生了甲基化，且癌组织中SPG20甲基化程度高于正常肺组织，SPG20甲基化程度与蛋白表达水平呈负相关。结合免疫组化和蛋白免疫印迹结果，提示肺腺癌中SPG20基因的高甲基化抑制了基因的转录，致使其翻译、合成的蛋白质下降。本研究还发现，SPG20甲基化程度随着肺腺癌TNM分期和组织分化程度的增加而逐渐增加，且和淋巴结转移密切相关。SPG20甲基化在有淋巴结转移者中表达升高，提示其可能促进了肺腺癌细胞自身的侵袭和迁移能力，进而使肺腺癌的恶性程度增强，导致其容易通过淋巴结发生转移。SPG20甲基化可能促进了肺腺癌细胞的无限制生长及恶性转化，导致癌细胞的局部浸润和远处转移。
综上所述，SPG20基因在肺腺癌中表达降低，而其甲基化程度增高，且其高甲基化状态与肺腺癌的分期、分化及淋巴结转移密切相关。SPG20基因甲基化调控在肺腺癌的发病机制中可能起着关键作用，但具体调控的分子机制仍有待进一步研究。在今后研究中可以将SPG20甲基化修饰作为切入点，深入研究其具体致癌机制，为肺腺癌的基因靶向治疗提供新的理论依据。
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