薛江鹏，莫治新，李有文，蔡吉祥，张怡萍，查向浩
（1. 喀什大学 化学与环境科学学院 **生物类固废资源化工程技术研究中心，** 喀什 844000；
2. 北京大学 环境科学与工程学院 水沙科学教育部重点实验室，北京 100871）
水体中的氮主要来自生物体的代谢和腐败，工业废水、生活污水的排放，以及氮肥的流失，氮是引起水质变坏和水体富营养化的主要污染源［1-2］，当水体中氮质量浓度大于0.2～0.3 mg/L时就会导致水体富营养化。因此，氮的转化去除是污水处理领域的研究热点之一。
微生物法是常用的脱氮方法［3］，通过硝化和反硝化两个过程实现脱氮［4-5］。硝化作用在好氧条件下将氨转化为氧化程度更高的氮化合物，如亚硝酸盐或硝酸盐，随后在无氧或厌氧条件下进行的反硝化过程中将进一步转化为氮气。有研究表明，这两个过程可在同一个反应器中同时发生，称为同步硝化-反硝化过程［6-8］。该过程无需两个独立的反应器或间歇曝气，从而简化了处理系统。
近年来，将纳米零价铁用于环境污染治理成为一种新型、高效的修复手段［9-13］。与普通铁粉相比，纳米零价铁因特有的表面效应和小尺寸效应而具有特殊的物理化学性质，具有显著的吸附作用和共沉淀作用［14-15］。工程应用中，微米零价铁（mZVI）作为一种具有还原活性和吸附能力的材料，寿命相对更长，不易钝化，且成本低、生物毒性小［16］，被广泛应用于废水处理领域。但mZVI用于去除硝酸盐氮（NO3--N）时，产物均为氨氮（NH3-N），对水体环境造成了二次污染，而微生物能够通过反硝化过程将硝酸盐氮转化为氮气。同时，mZVI在水中的无氧腐蚀过程中产生的氢可供给自养反硝化细菌进行生物反硝化作用，提升生物反硝化效率。
本研究对比了mZVI、微生物、微生物-mZVI工艺的脱氮效果，考察了mZVI投加量、废水pH、初始硝酸盐氮浓度、反应时间对微生物-mZVI工艺脱氮效果的影响，结合高通量测序和环境扫描电子显微镜（ESEM）得到优势菌属，并对脱氮机理进行了推测分析。
1.1 试剂和材料
实验所用试剂均为分析纯。
mZVI：由金沙纳米技术有限公司提供，铁质量分数98.5%，松装密度0.95 g/cm3，费氏粒度1.5 μm。微生物：复合菌剂BP350，购自北京博瑞康沐生物技术有限公司，呈棕色粉末状。
模拟废水：在自来水中添加KNO3、无水葡萄糖（600 mg/L）、KH2PO4（270 mg/L）配制而成。
1.2 实验方法
将5 g微生物与1 200 mL模拟废水置于锥形瓶中，设定初始硝酸盐氮质量浓度在25 mg/L以上，从而使反硝化菌处于优势地位。向容器中通入氮气保持厌氧条件，以1∶4 000的体积比投加无水乙醇做为电子供体，室温下驯化至硝酸盐氮彻底还原。取50 mL反硝化后溶液接种于新鲜模拟废水中，反复上述操作，直至硝酸盐氮的去除率恒定，视为驯化完成，得到实验用菌液。
室温下取1 000 mL模拟废水于锥形瓶中，调节废水pH至设定值，并加入一定量的mZVI和50 mL菌液后置于转速为150 r/min恒温振荡器中，实验过程中通入氮气以保证厌氧环境，反应一段时间后取样过滤，测定滤液的氮含量。
1.3 分析方法
硝酸盐氮的测定采用紫外分光光度法［17］；
氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法［18］；
亚硝酸盐氮（NO2--N）的测定采用分光光度法［19］；
pH的测定采用pH-201型pH计（意大利HANNA公司）。
采用Quanta 200 FEG型ESEM（美国FEI公司）表征反应前后体系的微观形貌变化。
污泥样品以10 000 r/min转速离心20 min，弃去上清液。称取1.0～1.5 g浓缩样品，采用D5625-01型土壤基因组提取试剂盒（OMEGA公司）提取DNA，并交由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序。
2.1 微生物-mZVI工艺的优势分析
在废水pH为7.0、初始硝酸盐氮质量浓度为25.00 mg/L、mZVI投加量为为0.20 g/L的条件下，3种工艺的脱氮效果对比见图1。由图1可见：单独mZVI或微生物工艺中，5 d后硝酸盐氮浓度分别为22.01，0.87 mg/L；
而微生物-mZVI组合工艺中，3 d后硝酸盐氮浓度降至0。上述结果表明，mZVI能够提升微生物的脱氮能力，使硝酸盐氮去除率达100%，组合工艺比单独mZVI或微生物工艺更具脱氮优势。
图1 3种工艺的脱氮效果对比
2.2 组合工艺脱氮效果的影响因素
2.2.1 反应时间
在废水pH为7.0、初始硝酸盐氮质量浓度为25.00 mg/L、mZVI投加量为为0.20 g/L的条件下，不同种类氮浓度随时间的变化见图2。
图2 不同种类氮浓度随时间的变化
由图2可见：第1 d硝酸盐氮的去除速率较慢，浓度仅降至21.48 mg/L，随着反应的进行，去除速率加快，3 d后浓度降至0；
2 d后，体系中氨氮质量浓度从0升至6.32 mg/L，由于mZVI还原硝酸盐氮的产物主要是氨氮，氨氮又用于微生物细胞合成，随着反应的进行而消耗，最终趋近于0；
而亚硝酸盐氮2 d后仅升至1.25 mg/L，3 d后又降至0.03 mg/L。这表明在转化过程中产生的氨氮量明显高于亚硝酸盐氮，可能是因为mZVI与硝酸盐氮反应生成亚硝酸盐氮，而氨氮为电子供体，亚硝酸盐氮为电子受体，微生物以亚硝酸盐氮为氮源，最终将其消耗尽。综上，选择反应时间为5 d较适宜。
2.2.2 废水pH
在反应时间为5 d、初始硝酸盐氮质量浓度为25.00 mg/L、mZVI投加量为为0.20 g/L的条件下，实验考察了不同废水pH条件下的脱氮效果，结果如图3所示。pH为6.8和7.0时，硝酸盐氮的去除率达100%，氨氮和亚硝酸盐氮的总生成率（生成的氮浓度占初始硝酸盐氮浓度的百分比）分别为8.24%和5.00%，而pH为7.2时，虽然只去除了88.29%的硝酸盐氮，但生成的亚硝酸盐氮和氨氮的总生成率最低，为2.14%。pH向强酸性或强碱性变化时，硝酸盐氮的去除率均逐渐降低，并且氨氮生成量逐渐升高。这可能因为反硝化反应还原硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的过程中会产生OH-，在碱性和酸性条件下硝酸盐氮会被mZVI还原为氨氮，而在中性条件下硝酸盐氮在微生物和mZVI的共同作用下被还原成氮气。综上，中性条件能提升复合体系的脱氮效果，选择废水pH为7.0较适宜。
图3 废水pH对脱氮效果的影响
2.2.3 初始硝酸盐氮浓度
在反应时间为5 d、废水pH为7.0、mZVI投加量为为0.20 g/L的条件下，实验考察了不同初始硝酸盐氮浓度条件下的脱氮效果，结果如图4所示。初始硝酸盐氮浓度不高于25.00 mg/L时，硝酸盐氮的去除率均可达100%，而氨氮和亚硝酸盐氮的总生成率相似，均为5.00%左右。继续增加初始硝酸盐氮浓度，硝酸盐氮的去除率逐渐降低，增至100.00 mg/L时硝酸盐氮的去除率降至78.00%，同时生成9.60%的氨氮和0.64%的亚硝酸盐氮。上述结果表明，组合工艺对硝酸盐氮具有较强的脱除能力。
图4 初始硝酸盐氮浓度对脱氮效果的影响
2.2.4 mZVI投加量
在反应时间为5 d、废水pH为7.0、初始硝酸盐氮质量浓度为25.00 mg/L的条件下，实验考察了不同mZVI投加量条件下的脱氮效果，结果如图5所示。当mZVI投加量为0.20～0.80 g/L时，硝酸盐氮的去除率均大于99.50%，而氨氮和亚硝酸盐氮的总生成率相似，均为5.00%左右。继续增加mZVI投加量，硝酸盐氮的去除率略有下降。当mZVI投加量低于0.20 g/L时，随着投加量的降低硝酸盐氮的去除率逐渐降低，而氨氮和亚硝酸盐氮的总生成量增加，投加量降为0时即为单独微生物工艺。综合考虑，选择mZVI投加量为为0.20 g/L较适宜。
图5 mZVI投加量对脱氮效果的影响
2.3 微生物群落结构分析
2.3.1 物种注释
微生物样品注释到各分类水平上的序列数目如图6所示，表明微生物工艺与组合工艺体系中微生物的种类没有显著差异。
图6 微生物样品各分类水平上的序列数目
2.3.2 物种分布情况
根据物种注释结果，选取每个样品在各分类水平上相对丰度排名前10的物种进行分析，以门和属水平为例，结果分别见图7和图8。
由图7可见，在两个工艺体系中，门水平上主要存在的是变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）。以上菌门中，只有变形菌门包含了固氮类的细菌［20］，而该门类菌在组合工艺体系中的相对丰度（60.39%）高于单独微生物工艺体系（54.66%）。在mZVI存在的情况下，mZVI可作为基质，使变形菌门类菌附着于其上生长繁殖，从而增加了细菌数量。
图7 门水平物种相对丰度
由图8可见，以属为水平的微生物种类中，前10位依次为甲基娇养杆菌属（Methylotenerasp.），金黄杆菌属（Chryseobacteriumsp.），厌氧单胞菌属（Dysgonomonassp.），丛毛单胞菌属（Comamonassp.），不动杆菌属（Acinetobactersp.），碱杆菌属（Alcaligenessp.），固氮弓菌属（Azospirasp.），寡养单胞菌属（Stenotrophomonassp.），丙酸杆菌属（Caloramatorsp.），孢子菌属（Sporomusasp.）。甲基娇养杆菌属在组合工艺体系中的相对丰度为41.81%，数量最多，且远高于该属在单独微生物工艺体系中的相对丰度（11.63%），该类菌种可发挥除氮作用。
图8 属水平物种相对丰度
2.4 组合工艺脱氮机理分析
2.4.1 ESEM分析
不同体系反应前后的ESEM照片见图9。由图9可见：单独微生物工艺反应后，微生物形态多为球状；
组合工艺反应后，微生物形态多为杆状，菌体分泌的胞外聚合物使其聚合生长在一起。微生物可附着于mZVI上生长，增加了微生物的数量，防止其流失，且增大了与废水的接触面积。
图9 不同体系反应前后的ESEM照片
2.4.2 机理推测
根据以上分析可以看出：单独微生物工艺与组合工艺体系中，微生物的种类差别不大，并且发挥主要脱氮作用的菌种相同；
但在组合工艺体系中，甲基娇养杆菌属的数量远高于单独微生物工艺体系，表明mZVI的加入增加了该种菌属的数量。由此，推测组合工艺脱氮机理主要包括两个方面：一方面是微生物的反硝化作用，通过对复合微生物BP350的驯化并与mZVI复合，mZVI在水中的分散颗粒为微生物生长提供了附着基质，增大了体系中微生物与废水的接触面积，提升了优势菌属的数量，最终使甲基娇养杆菌属占优势，该菌属通过反硝化过程将硝酸盐氮先转化成亚硝酸盐氮，随后转化成氮气［21］，微生物的引入可加快mZVI的腐蚀并利用腐蚀产氢提供的电子进行反硝化［22］；
另一方面是mZVI的还原作用，在厌氧环境下，mZVI可将水中的硝酸盐还原成氨氮，从而降低硝酸盐氮浓度。组合工艺脱氮时，有一定的化学作用，但微生物作用起主导作用。综上，mZVI能够协同微生物提升脱氮效果。
a）与单独微生物或mZVI工艺相比，微生物-mZVI工艺的脱氮效果最好。
b）室温下采用微生物-mZVI工艺脱氮，在废水pH为7.0、初始硝酸盐氮质量浓度为25.00 mg/L、mZVI投加量为为0.20 g/L的条件下，加入驯化好的复合微生物BP350菌液50 mL/L反应5 d，硝酸盐氮去除率达100%，氨氮和亚硝酸盐氮的总生成率为5.00%。
c）ESEM表征结果表明，mZVI在水中为微生物生长提供了附着基质，进而增大了微生物与废水的接触面积，还能有效防止微生物流失。
d）高通量测序结果表明，在属水平上，甲基娇养杆菌属（Methylotenera sp.）作为脱氮的优势菌属在微生物-mZVI工艺体系中相对丰度最高，达41.81%，且远高于该属在单独微生物工艺体系中的相对丰度（11.63%）。
e）mZVI能够协同微生物提升脱氮效果，通过微生物的反硝化以及mZVI的还原作用，能有效缩短脱氮时间，提升脱氮效率。
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