刘宝玲，蔡汝健
(1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州 510220；
2.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东广州 510640)
使用抗生素是预防和治疗细菌性疾病感染的有效手段之一，但由于抗生素的长期使用、滥用导致细菌耐药问题也日趋凸显，甚至出现了多重耐药或是超级耐药细菌，导致细菌感染的疾病治疗愈发难以用药，甚至无药可治。细菌对抗生素的耐药性已经被世界动物卫生组织(WOAH)确定为人类公共卫生方面面临的三个主要问题之一[1]。
细菌生物被膜的形成是细菌耐药的一个重要原因。许多致病菌聚集后会形成生物被膜，为细菌提供一层保护屏障，使细菌在一定程度上逃避抗生素或者消毒剂的损伤。张丽蓉等[2]研究发现形成生物被膜的细菌对消毒剂的抵抗力增强。研究表明，形成生物被膜的表皮葡萄球菌对常用于表皮葡萄球菌治疗的抗生素的耐受性明显增强[3]。与浮游菌相比，形成生物被膜的细菌耐药性增强，可以逃避宿主免疫作用和抗生素杀伤，使得感染部位细菌难以彻底清除，导致感染久治不愈，因此，新型抗菌药物的研发与应用具有重要意义。
近年来，纳米银(AgNPs)由于自身的物理、化学和生物学特性，在抗菌抗生物被膜方面受到广泛的关注。AgNPs对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性都具有明显的抗菌和抗生物被膜作用，有研究报道了AgNPs对多重耐药肺炎克雷伯菌的抗菌和抗生物被膜的作用[1]。研究表明，AgNPs能有效抑制枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的生长[4]，AgNPs对多重耐药铜绿假单胞菌具有明显的抗菌作用[5]。AgNPs的抗菌、抗生物被膜作用已被广泛证实，但其作用机制尚未得到充分阐明。本文主要从AgNPs的抗菌机制、AgNPs抗生物被膜机制以及AgNPs的应用前景和局限性等方面阐述AgNPs抗菌及抗生物被膜的研究进展。
AgNPs是以原子结构组成的纳米银粒子，粒径在1 nm～100 nm之间，因其具有高效、广谱、不易产生耐药的特点，被认为是抗生素潜在的优质替代品。AgNPs可以通过物理、化学和生物方法制备，其中物理方法速度快，不涉及危险化学品，但产能低、耗能高；
化学方法生产方便成本低、产量高，但涉及危险化学品、不纯且可能不稳定。目前，生物方法被认为是一种简单、无毒、可靠和绿色的方法[6]。AgNPs的生物活性取决于表面化学、大小、尺寸分布、形状、颗粒形态、颗粒组成、涂层、聚集和溶解速率、溶液中的颗粒反应性、离子释放效率和细胞类型，此外，用于合成AgNPs的还原剂类型是决定细胞毒性的关键因素[7]。
大量的研究表明AgNPs具有显著抗菌作用，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有较强的抗菌或杀菌作用。AgNPs的抗菌机制主要包括破坏细胞壁和细胞膜、DNA损伤、诱导氧化应激、抑制重要功能蛋白等。
2.1 AgNPs对细胞壁和细胞膜的破坏
细胞壁和细胞膜是细菌的重要保护屏障，AgNPs的作用会破坏这个屏障。据报道，AgNPs与细菌直接接触后可附着在细胞壁上，致使糖链断裂，改变细菌细胞壁肽聚糖的总构型，导致细菌细胞壁被破坏，进一步渗透，从而改变膜的理化性质，进而引起膜内物质的泄露而导致细菌死亡[8]。研究证明，沙门氏菌内膜的通透性会随着AgNPs作用浓度的增加而增加[9]。由心叶青牛胆茎提取物还原合成的AgNPs与金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌膜蛋白的相互作用，导致zeta电位的交替与膜透性的增强，破坏细胞膜的稳定性[10]。由黄孢原毛平革菌提取物还原合成的AgNPs能使大肠埃希氏菌细胞膜的完整性丧失[11]。由于AgNPs对细胞膜破坏，细胞外聚合物的产生减少，细胞糖类、蛋白泄漏增加，进而导致细菌的死亡[1,12]。
2.2 AgNPs造成DNA损伤
DNA是细菌的重要遗传物质，AgNPs可使DNA不再随机的分布于核区，而是在核区浓缩呈紧张状态、进入细菌体内，抑制细菌的翻译过程，或是直接造成DNA的损伤[13]。由香菜叶提取物还原合成的AgNPs作用于枯草杆菌后释放Ag+介导DNA损伤，导致细菌死亡[14]。AgNPs对大肠埃希氏菌的DNA有损伤[15]。
2.3 AgNPs引起氧化应激
AgNPs导致的氧化应激是其发挥抗菌作用的重要原因。研究表明，AgNPs通过促进氧化应激，导致过量活性氧(ROS)产生，造成氧化损伤。研究发现AgNPs导致多重耐药铜绿假单胞菌内抗氧化酶如过氧化物酶、过氧化氢酶活性下降，无法消除过量的ROS，引起氧化和抗氧化的失衡导致细菌死亡[5]。由槲皮素还原合成的AgNPs作用于铜绿假单胞菌葡萄球菌后，谷胱甘肽的浓度下降，产生过量的ROS使细菌抗氧化系统不堪重负，导致氧化应激并最终丧失活性[16]。
3.1 细菌生物被膜
3.1.1 细菌生物被膜的结构 生物被膜是指细菌黏附于表面形成的自我保护的细菌结构[18]。生物被膜主要由两部分构成，分别是微生物细胞及细胞外聚合物(EPS)[19]，其中微生物细胞附着在物体表面，由EPS组成的复杂基质包裹，其主要成分包括多糖、胞外DNA和蛋白质[20]，这样的组成增强了细菌抵抗宿主免疫反应及抗菌药物的攻击能力。EPS由细菌自身分泌或营养丰富的环境提供，因此，生物被膜的结构和组成，在细菌之间可能有所不同，同一种细菌在不同的环境条件下也可能存在几种不同类型的生物被膜。
3.1.2 生物被膜的形成过程 细菌生物被膜既可以在环境非生物表面形成，也可以在生物表面形成，并且受到多种信号及基因的调控。一般认为生物被膜的形成过程主要分为五个阶段[21]；
第一阶段细菌可逆的附着在机体的表面；
第二阶段细菌不可逆转地黏附定植，这一阶段能够使细菌牢固地黏附在表面；
第三阶段是形成菌落之后结构分化；
第四阶段是成熟发展；
第五阶段是解聚再定植，这一阶段生物被膜内细菌再次成为浮游状态[22]，可渗透和定植于其他部位再形成生物被膜，构成一个新的循环的过程。因此，病原细菌形成生物被膜后不但可增加自身的存活概率，而且能对宿主造成持续的感染。
3.1.3 生物被膜的危害 当前，形成生物被膜的病原微生物感染已成为医疗卫生的一个棘手问题，细菌能够黏附医疗器械和体内植入物品上形成生物被膜，导致感染并难于清除，最后造成严重的医疗事故[22-23]。细菌形成生物被膜后，耐药性增强[24]，抗生素的治疗效果大大降低。
3.2 AgNPs的抗生物被膜机制
细菌对抗生素的抗性可能是由于生物被膜基质中抗生素渗透性差，微环境改变或细菌的适应性反应引起的，如果能够有效抑制生物被膜的形成，就能够大大提高抗生素的治疗效果。AgNPs的抗生物被膜活性已经在很多研究中得到了证实。研究发现通过生物方法合成的AgNPs表现出生物被膜破坏性特性，减少大肠埃希氏菌生物被膜量[25]。AgNPs对多重耐药金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有较好的抗生物被膜活性[26]。目前，AgNPs抑制细菌生物被膜的机制主要包括抑制细菌生物被膜相关基因的表达、阻止细菌黏附、阻断群体感应、氧化应激等。
3.2.1 抑制细菌生物被膜相关基因的表达 生物被膜的形成受多种信号和基因的调控，相关研究表明AgNPs能抑制细菌生物被膜相关基因的表达。AgNPs通过抑制生物被膜相关基因的表达抑制细菌生物被膜的生长[27]。AgNPs(Ag@Glu/TscNPs)能通过抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)生物被膜相关基因ICA和ICAD的表达来抑制其生物被膜的形成[28]。由香根草根提取物合成的AgNPs(VzAgNPs)通过下调生物被膜形成相关基因bsmB、fimA和fimC来抑制黏质沙雷氏菌的生物被膜的形成[29]。AgNPs通过减少bap、OmpA和csuA/B的表达而减少鲍曼芽孢杆菌生物被膜的形成[30]。
3.2.2 阻止细菌黏附或聚集 细菌黏附于表面是生物被膜形成的首要条件，AgNPs通过阻止细菌黏附或聚集来破坏生物被膜的形成。研究表明，AgNPs通过破坏细菌胞外聚合物(EPS)基质来阻止细菌黏附或聚集，进一步影响细菌生物被膜的形成[1]。VzAgNPs作用后黏质沙雷氏菌EPS产生量显著减少[29]。此外，有研究报道AgNPs通过释放银离子(Ag+)改变生物被膜的黏附性、结构和孔隙率[31]，达到阻止细菌黏附或聚集作用。
3.2.3 阻断群体感应 群体感应是细菌间的通信系统，可利用信号分子来调节生物被膜形成。研究发现[32],AgNPs可以通过抑制LasI/RhlI合成酶来阻断信号分子的生物合成，从而影响生物被膜形成。AgNPs降低了信号分子邻氨基苯甲酸的浓度，进而影响群体感应系统[33]。单宁酸与AgNPs复合物具有抑制群体感应信号子生成的作用[34]。
3.2.4 诱导氧化应激 AgNPs诱导的氧化应激是其抗菌机制之一，也是其抗生物被膜机制之一。研究表明,AgNPs通过诱导铜绿假单胞菌发生氧化应激而发挥抗生物被膜作用[33]。
AgNPs因其独特的性质在生物医学中的应用越来越广泛，主要应用领域包括了抗菌、抗病毒、抗癌、组织工程以及伤口护理等。近年来AgNPs广泛应用于生物医学，但它的毒性也受到广泛关注。研究表明体内使用高剂量AgNPs时会对体内生化指标造成负面影响，甚至对哺乳动物的生殖发育会产生不良影响[35]。但有研究发现在可接受浓度下AgNPs对实验动物未造成不良影响[36]。AgNPs的安全性可能与AgNPs的合成方式、形态、剂量、结构及颗粒大小密切相关。AgNPs的长期使用也会使微生物产生耐药性，研究发现反复暴露于亚抑制浓度的AgNPs的大肠埃希氏菌会对AgNPs产生稳定的耐药性，这可能是细菌通过增加对AgNPs释放的银离子的外排而产生抗性[37]。
AgNPs是一种新型广谱高效的抗菌及抗生物被膜的生物材料，通过绿色合成、颗粒大小、形态、使用剂量、包被等降低其毒性的研究，为开发新型广谱高效、不易耐药的生物医药及临床应用提供可靠数据和理论依据。
AgNPs是良好的广谱抗菌材料，论文从AgNPs的抗菌机制、抗生物被膜机制阐述了AgNPs对细菌的作用机制，AgNPs通过多种机制产生抗菌抗生物被膜作用，目前AgNPs广泛的抗菌抗生物被膜作用已经被证明，但是其抗菌抗生物被膜的机制仍不完全清楚，并且因其本身的性质，它的应用也存在一定的局限性。探索AgNPs的具体作用机制及如何克服其毒性将是未来相关研究的重点。
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