吴 竞，刘 灿，王科文
[1.硕腾（上海）企业管理有限公司，上海 长宁 200050；
2.硕腾生物制药有限公司，江苏 苏州 215127]
联合疫苗是指将多种活的或灭活的微生物以及抗原成分联合配制而成的疫苗，能够预防不同病原微生物引起的多种疾病或同一种病原微生物的不同血清型引起的疾病。在联合疫苗研发的过程中，需充分考虑组分间的相容性、非活性成分对联合疫苗的影响、佐剂对联合疫苗的影响以及联合疫苗的稳定性和有效期。联合疫苗的使用能简化免疫程序、提高接种人员的依从性以及降低疫苗的管理成本[1]。猪圆环和支原体的联合疫苗是近年来猪用疫苗中设计和研发的热点，从全国兽用生物制品批签发数量来看，圆支二联苗是市场对圆环疫苗和支原体疫苗更依赖的选择。2021年3月10日，硕腾公司的瑞圆舒®（猪圆环病毒1-2型嵌合体、支原体肺炎二联疫苗）正式获得中国农业农村部批准，成为我国首个获批的“即用型”猪用圆环支原体二联进口疫苗。瑞圆舒®适用于3周龄或3周龄以上的健康猪，用于预防猪圆环病毒2型引起的感染，减少因猪肺炎支原体感染引起的肺炎。瑞圆舒®自2013年在美国首次上市以来，其使用的安全性、经济性、有效性在全球范围内得到了广泛而充分的验证。本文介绍瑞圆舒®独特的研发和工艺特点，旨在分析其提升猪群健康福利，帮助养殖企业创造经济价值背后蕴含的科技价值。
在商品化的猪圆环支原体联合疫苗中，对于圆环抗原组分，通常选择猪圆环病毒2型的全病毒灭活抗原或者亚单位抗原（大肠杆菌表达系统或重组杆状病毒表达系统表达的Cap蛋白）。不同的是，瑞圆舒®选择了猪圆环病毒1-2型嵌合体病毒灭活抗原。
猪圆环病毒（porcinecircovirus, PCV）归属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种无囊膜单股共价环状DNA病毒，已发现4种PCV类型，分别为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，其中PCV3和PCV4尚未正式列入圆环病毒属[2]。PCV1首次在PK-15细胞的污染物中发现，无致病性。PCV2引起猪圆环病毒病（porcine circovirus disease, PCVD），PCVD有不同的临床表现，包括猪圆环病毒2型系统性疾病（PCV2-SD）、猪圆环病毒2型繁殖性疾病（PCV2-RD）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）和亚临床感染。PCV2基因组由11个推测的开放阅读框（ORFs）排列组成，但只有4个用于蛋白质的表达。ORF1和ORF2分别是PCV2基因组中两个最大的ORF，ORF1编码非结构复制酶Rep和Rep"蛋白，主要功能为参与病毒的复制；
ORF2编码唯一的结构蛋白（衣壳蛋白，Cap蛋白），该结构蛋白具有良好的免疫原性，是基因工程疫苗首选的目的基因。PCV1不同毒株之间或PCV2不同毒株之间的基因组序列同源性一般都超过90%，而PCV1和PCV2的同源性仅有68%～76%[3]。
2003年，Fenaux等首次报道了PCV1-2嵌合体病毒的构建[4]，并评估了PCV1-2嵌合体病毒的免疫原性和致病性。在该研究中，以不致病的PCV1基因组为骨架，用PCV2的ORF2基因替换PCV1的ORF2基因，构建成PCV1-2嵌合体病毒。体外试验表明，PCV1-2和PCV1、PCV2一样，都能在PK15细胞上复制；
动物试验表明，PCV1-2嵌合体病毒能够诱导机体产生特异性的抗体，产生较低的组织病理损伤、病毒血症、淋巴组织中的抗原定植（类似于非致病性PCV1的感染）。随后在2004年，Fenaux等评价了减毒的PCV1-2嵌合体病毒对PCV2病毒的免疫攻毒保护作用[5]，试验分为4组，第1组试验猪通过肌肉注射接种PCV1-2的感染性克隆，第2组试验猪通过淋巴注射接种PCV1-2的感染性克隆，第3组试验猪通过肌肉注射接种103.5 TCID50的PCV1-2病毒，第4组试验猪为对照组；
接种42 d后，对各组试验猪用PCV2攻毒。结果显示，攻毒21 d后，1～3组的试验猪没有检测到病毒血症，对照组试验猪则能检测到，且相对于对照组，1～3组的试验猪中只检测到轻微的PCV2淋巴结病毒定植、淋巴组织耗竭和组织细胞替换，说明PCV1-2的感染性克隆或病毒能够诱导针对PCV2感染的保护性免疫，该研究为PCV2疫苗的设计和研发提供了潜在策略。
虽然Gillespie等[6]的研究表明，PCV1-2嵌合体病毒在PK-15细胞上连续传代11次或在猪只体内连续传代3次后仍然保持高度的遗传稳定性，但在Hemann等[7]的研究中，用灭活的PCV1-2嵌合体疫苗和PCV1-2嵌合体活疫苗接种母猪，随后用PCV2精液攻毒，结果显示：灭活的PCV1-2嵌合体疫苗能诱导更好的抗体水平；
两种免疫策略都能帮助母猪很好地控制PCV2病毒血症，母猪的PCV2病毒血症水平和持续时间在两组之间没有显著差异，而相比于对照组，两组母猪后代中检测到的PCV2水平都显著降低。Li等[8]的研究发现，PCV1-2b嵌合体的灭活疫苗和活疫苗都能对PCV2b的感染产生保护性免疫。因此，灭活的PCV1-2嵌合体疫苗在保证有效性的同时，也保证了疫苗的安全性。
PCV2病毒在培养细胞上滴度的提升是PCV2全病毒疫苗研发和工艺上的难题之一。Beach等[9]的研究表明，相比于PCV2，PCV1-2嵌合体病毒感染PK-15细胞96 h后，产生了至少10倍多的感染性病毒，说明了PCV1-2嵌合体病毒优秀的复制能力。
PCV2主要的基因型有2a、2b、2c、2d和2e。1996年到2000年初，PCV2a是临床感染猪中最流行的基因型。2003年之后，PCV2b占主导地位。PCV2d首次在2010年报道于中国，近些年，PCV2d已成为临床上主要的流行基因型。商品化PCV2疫苗大多都基于PCV2a和（或）PCV2b生产或构建的全病毒灭活疫苗或亚单位疫苗[2]。在多个免疫攻毒保护试验中[10]，瑞圆舒®显示出对当前流行的PCV2d、PCV2a和PCV2b基因型的交叉保护效果。
在商品化的猪肺炎支原体疫苗或猪圆环支原体联合疫苗中的支原体组分，通常选择猪肺炎支原体的全菌体，不同菌株（如P5722-3株、J株、P株等）的猪肺炎支原体在发酵培养后经过灭活，加入佐剂配伍，制备成全菌体灭活疫苗[11]。不同的是，瑞圆舒®选择去除了支原体细胞的可溶性抗原。
猪肺炎支原体是一种菌体较小、无固定形状的多形性原核生物。猪肺炎支原体的不同菌株之间在基因组、抗原性和蛋白组水平上均呈现多样性。基因组的多样性使得猪肺炎支原体不同的菌株能够适应不同的环境，使它们能够更好地在宿主上定植，逃逸宿主的免疫反应或躲避药物引发的清除。目前，有23个猪肺炎支原体菌株完成了全基因组测序，其中11个完成了组装和注释，另12个还没有完全组装。猪肺炎支原体的基因组很小，在0.86～0.96 Mb之间，每个基因组中有528～691个蛋白质编码基因。虽然基因组很小，但我们对猪肺炎支原体基因组的了解非常有限，接近30%的基因功能未知。猪肺炎支原体基因中有20%～30%编码膜蛋白，其中很多蛋白的功能也尚不清楚。疫苗免疫在世界范围内被广泛应用于控制猪支原体肺炎，商品化的疫苗主要由灭活的全菌体和佐剂制成，虽然给仔猪接种疫苗能减少猪肺炎支原体感染引起的生产性能损失，提高日增重、改善饲料转化率、降低死亡率、在更短的时间达到上市重、减少上市重的差异、减少呼吸道中猪肺炎支原体病原的数量、降低流行率和病变程度等，但疫苗免疫不能对临床症状和支原体样肺部病变提供完全的保护，不能阻止猪肺炎支原体在体内的定植。商品化的猪肺炎支原体疫苗起到的部分保护作用的机制还不完全清楚[12]。
在Okada等[13]的研究中，将猪肺炎支原体培养之后，离心，取全细胞沉淀（重悬后的终浓度为1010CCU/0.2 mL）和没有细胞的培养基上清液（低于101CCU/0.2 mL）分别作为两个试验组的疫苗，对照组为BHL培养基（不含猪肺炎支原体），将3组疫苗灭活后接种试验猪，4周龄首免，6周龄二免，8周龄时对3组试验猪用猪肺炎支原体攻毒。结果显示：在攻毒后的4周，检查试验猪的肺部病变，对照组中100%的猪（5/5）出现了肺部病变，病变的比例为（12.2±2.2）%，全细胞沉淀组中80%的猪（4/5）出现了肺部病变，病变的比例为（18.7±16.5）%，培养基上清组中60%的猪（3/5）出现了肺部病变，病变的比例为（3.2±3.9）%。在对肺部匀浆进行细菌学检测后，对照组猪肺炎支原体的浓度为106.2CCU/0.2 mL，全细胞沉淀组为105.8CCU/0.2 mL，培养基上清组为104.2CCU/0.2 mL。该结果说明猪肺炎支原体的培养基上清液能更显著地减少由猪肺炎支原体引起的肺部病变。同时，该研究发现主要的猪肺炎支原体特异性抗原（97、89、65、46、42和41 kDa的蛋白等）在全细胞和上清液中都有表达，这些特异性的蛋白可能跟观察到的保护相关。在随后的研究中[14]，Okada用铝佐剂乳化猪肺炎支原体培养基上清液制成疫苗，在3个猪群免疫（A、B、C），A是SPF猪群，B是没有明显呼吸道感染症状的高健康状态猪群，C是有明显呼吸道感染症状的低健康状态猪群。在3个猪群中各设立免疫组和对照组，免疫组接种猪肺炎支原体的培养基上清液疫苗，对照组不免疫。结果显示，在猪群A中，免疫组在二免后的4周内检测到抗体反应，而且这种抗体可以持续12周。在猪群B和猪群C中，相对于未免疫组，免疫组中的试验猪有显著少的肺部病变、更少的猪肺炎支原体定植。而且，在猪群C中，疫苗免疫提升了日增重，改善了料重比，缩短了上市日龄。
Okada等[15]另一项研究表明，相比于不免疫组，接种猪肺炎支原体的培养基上清液疫苗的试验猪在攻毒后，肺部病变更少，浸润到气管的炎性细胞和支气管周围的T细胞聚集更少，肺泡灌洗液中的TNF-a也更少，说明疫苗的免疫可能抑制了支原体感染引起的肺部炎症细胞反应，导致较少的肺部病变。
在硕腾的一项独立研究中[16]，用3组浓度不同（低、中、高）的猪肺炎支原体细胞沉淀与PCV1-2嵌合体病毒制成联苗，免疫试验猪后用猪肺炎支原体攻毒，攻毒后剖检查看肺部病变的比例和范围，评价针对猪肺炎支原体感染的免疫保护作用。结果如表1显示，攻毒后，T02组、T03组、T04组试验猪出现肺部病变的比例和病变范围较T01对照组没有减少，说明无论浓度高低，只使用猪肺炎支原体细胞沉淀，都不能对猪肺炎支原体的感染起保护作用。
表1 不同浓度猪肺炎支原体细胞沉淀与PCV1-2嵌合体联用后的免疫攻毒试验
因此，在瑞圆舒®的研发过程中，为了保证支原体抗原组分的安全性和更准确的免疫应答，采取了“无菌体”的抗原形式，减少疫苗成分中的总生物质，减少了动物机体对疫苗中不必要成分的无效应答。
在瑞圆舒®的研发和生产工艺中，用到的一个核心工艺就是A蛋白层析技术。猪肺炎支原体培养困难，受多种因素影响，如血清的种类及浓度、培养基的成分、生产种子的接种密度、发酵转速、通气量等，猪肺炎支原体的高密度生产受到发酵工艺的限制。血清是猪肺炎支原体发酵培养的重要营养物质，常用的血清种类有猪血清、牛血清和马血清，而猪血清比牛血清和马血清的支原体发酵滴度更高。有研究表明，在同等浓度下，猪血清的支原体发酵滴度是牛血清的3倍，是马血清的5.3倍，因此猪血清对猪肺炎支原体的生长繁殖发挥着重要的作用[17]。但猪血清中通常会含有PCV2的抗体和其他杂蛋白，如果要构建猪圆环肺炎支原体的二联疫苗，必须要考虑清除这些抗体的影响，因为联合疫苗是由多种抗原成分联合配制而成，在对其进行质量控制研究时应考虑联合疫苗各组分间的相互作用，对疫苗中的每一个种类都应单独检测其效力。如果不去除猪肺炎支原体抗原组分中的PCV2抗体，当与圆环抗原组分联合时，PCV2抗体会部分阻断圆环抗原，影响圆环抗原组分的免疫效力，以及对圆环抗原组分效力检测造成干扰。硕腾的科学家在研发瑞圆舒®时，曾尝试在培养猪肺炎支原体时不添加血清或使用不含PCV2抗体的血清，甚至不使用猪肺炎支原体培养基上清液（因含有大量PCV2抗体及其它无关IgG抗体），只使用猪肺炎支原体细胞沉淀，效果都不尽如人意。
A蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal protein A, SpA）的简称。A蛋白可以与人及多种哺乳动物的IgG的Fc片段发生可逆的特异性结合，且不影响IgG与抗原的结合活性，因此也称为“生物海绵”。这一免疫学特性使得A蛋白广泛应用于抗体的检测、分离纯化等领域，如在单抗药物工业规模生产中，A蛋白亲和色谱填料通常用于从细胞培养液中高效捕获抗体蛋白。金黄色葡萄球菌本身是一种致病力较强的病原菌，A蛋白作为重要的独立因子存在于90%以上的金黄色葡萄球菌菌株中，直接从菌株细胞壁上分离得到的A蛋白存在安全隐患，且蛋白收率较低，目前市场上用到的A蛋白绝大多数是从基因工程化的大肠杆菌中分离纯化得到。在单抗的工业生产中，由于填料价格昂贵，A蛋白亲和色谱步骤的成本占整个下游加工成本的30%～50%[18]。
将A蛋白技术应用于瑞圆舒®的生产工艺中，A蛋白对猪肺炎支原体发酵培养液中的PCV2抗体和其他无关IgG抗体有强结合作用，使猪肺炎支原体抗原组分中仅含有支原体可溶性的抗原，在不影响圆环抗原使用效价和检测效价的情况下与圆环抗原组分相容，获得了联合疫苗的成功。以A蛋白作为亲和配基的亲和色谱具有高度选择性和亲和力，在生物下游纯化工艺中表现出众多的突出优势，但高额的成本给生物制品企业带来较大的经济负担，A蛋白技术在兽用疫苗领域使用的报道极为少见。硕腾公司通过改良和创新，将这种先进的纯化工艺应用到猪圆环支原体二联疫苗中，为其他兽用联合疫苗的研发和工艺提供了新的思路。
灭活疫苗通常要添加佐剂提高其免疫原性。佐剂是一种非特异性的免疫增强剂，与疫苗抗原配伍使用，可以辅助特异性抗原进入机体，增强机体对特异性抗原的免疫应答。佐剂可以帮助减少疫苗接种频次、减少抗原量、改善免疫反应质量、改善疫苗配方稳定性等。常见的疫苗佐剂有铝盐佐剂、油乳佐剂、细胞因子佐剂、免疫刺激复合物佐剂、纳米佐剂、动植物性来源的佐剂、细菌来源佐剂、核酸佐剂等[19]。在瑞圆舒®中，用到的佐剂是硕腾专有的Metastim佐剂，这是一种基于脂质的水包油佐剂，又称为SP油。Metastim佐剂对多种抗原有效，包括灭活的细菌和病毒、活病毒、类毒素、质粒DNA和重组蛋白。
佐剂可以增强动物机体对抗原的免疫反应，佐剂的作用和重要性在疫苗的研发中经常被低估。现有的动物疫苗佐剂越来越多，也越来越复杂，作用机制多，但很多都处于未知阶段。佐剂可通过延长抗原对机体的暴露时间、提高抗原递呈效率、驱动免疫应答的方向来发挥作用。但对于联合疫苗，包含的抗原是不同的，大小和复杂性不同（如细菌和病毒），机体对抗原产生的免疫应答类型是不同的（如体液免疫和细胞免疫），一种佐剂对一种抗原有效，未必对另一种抗原有效，因此，筛选出一种对联合疫苗中所有抗原组分都有效的佐剂也是联苗研发中一个巨大的挑战。在瑞圆舒®研发过程中，进行了不同佐剂的体外毒性测定、体内安全性测定，及与二联苗配伍后，进行PCV2和猪肺炎支原体的免疫攻毒保护试验（体内效力测定），最后根据安全性和效力，选择最适合瑞圆舒®的佐剂。在Bubolz等[20]的研究中，将PCV1-2嵌合体病毒、猪肺炎支原体可溶性抗原与不同佐剂配伍，T01组为对照组（生理盐水），T02组为二联苗+Metastim佐剂，T03组为二联苗+5% Amphigen佐剂，T04组为二联苗+5%Amphigen佐剂+5% SLCD佐剂。在第1组试验中，将3周龄仔猪分为4组，每组16头，分别接种4种疫苗（T01～T04），6周龄时对各组试验猪用PCV2攻毒，9周龄时剖检。检测各组试验猪攻毒前后的病毒血症、鼻腔，粪便排毒、解剖后淋巴组织病变及PCV2定植情况。结果如图1显示：攻毒后，相比对照组（T01），3组免疫组都能显著降低PCV2病毒血症；
攻毒后7 d和14 d，T02组和T04组比T03组有显著低的病毒血症。说明T02组和T04组针对圆环的感染有更好的保护作用。在第2组试验中，将3周龄仔猪分为4组，每组16头，分别接种4种疫苗（T01～T04），6周龄时对各组试验组用猪肺炎支原体攻毒，10周龄时剖检，检测各组试验猪剖检时的肺部病变。结果显示，对照组（T01）试验猪的平均肺部病变比例是13.1%，T02组为4.3%，T03组为4.7%，T04组为12.0%，说明T02组和T03组针对支原体的感染有更好的保护作用。综合以上两组试验，T02组（Metastim佐剂组）对两种病原的感染都能起到保护作用。
Metastim佐剂在牛、马和猪的疫苗中使用多年。Metastim能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，但这种活性机制尚不完全清楚。在Horohov等[21]的研究中，分别用Metastim佐剂、磷酸铝佐剂和生理盐水和灭活的马流感病毒配伍后进行试验马多个部位的皮内接种，在注射后的不同时间进行活检。结果显示，相比与铝佐剂，含有Metastim佐剂的疫苗能够产生更多的IFN-γ、IL-12、CD4和CD83；
Metastim除了能诱导产生Th2细胞因子外，相比与铝佐剂，能产生更多的Th1免疫反应。铝盐佐剂通常优先刺激体液免疫，基于脂质的佐剂（Metastim）通常在刺激细胞免疫方面更有效。
基于以上的抗原选择和工艺特点，通过安全性试验（如临床观察、注射部位反应、过敏反应、直肠温度等），针对猪肺炎支原体感染的保护试验（如肺部病变和血清学），针对PCV2感染的保护试验（如病毒血症、鼻腔排毒、粪便排毒、组织病理学、细胞免疫、血清学等）确定Metastim与抗原成分的最小免疫剂量，确定最终的疫苗配方。
本文介绍了瑞圆舒®的研发和工艺中所用到的创新技术，首先是抗原的选择，PCV1-2嵌合体种毒稳定、培养效率高、抗原构象完整、猪源细胞培养没有外源抗原，猪肺炎支原体抗原去除支原体细胞、保留可溶性抗原、安全性更好、免疫应答更精准；
A蛋白技术去除不必要的生物原料，解决了两种抗原兼容性的问题；
专有的Metastim佐剂对两种抗原均有效；
最后通过工艺的优化实现相应的大规模生产。
目前，商品化猪用联合疫苗的种类还不是很多，但从业者对联苗的需求众多。联苗更方便、省时省力、减少因多次接种疫苗对猪只造成的应激、减少交叉污染、减少疾病传播风险，利于生物安全防控。未来的猪用联合疫苗一是往多种病原、多种价次的联合疫苗发展，一针防多病，简化猪群复杂而频繁的免疫程序；
二是联合疫苗将优化各个组分的形式和含量，明确各组分的作用，评估各个抗原组分间的相互作用；
三是通过对佐剂工艺的优化，开发出适用于多种抗原的佐剂，明确佐剂的作用机理，适当调整相应抗原含量，在保证有效性的同时获得最佳的安全性。除了安全性和有效性，还需关注联合疫苗在田间应用的场景，比如免疫程序的兼容性，各个单苗接种时间不同是联合疫苗研发中面临的另一大挑战。